近日，Nature Communications杂志发表一篇文章，介绍了一种微流控电穿孔系统，结合两步脉冲刺激方法，以产生大量过表达CD64的sEVs，并在其内部招募能够表达 IFN-γ 的mRNA。在这些治疗性sEVs中，CD64作为抗CD71和抗PD-L1抗体的对接位点，以促进sEV靶向到胶质母细胞瘤细胞（GBM）。该研究展示了这些免疫sEVs（imsEVs）可以成功靶向GBM并在体内诱导免疫疗效。此外，这种imsEV在到达肿瘤微环境后，可以引起主要组织相容性复合物I（MHC-I）的表达上调，避免可能由其下调触发的免疫逃逸，从而增强免疫疗法的抗肿瘤效果。这种imsEV是一种可以实现mRNA装载、肿瘤靶向和微环境调节，以提高癌症免疫疗法有效性的潜在方法。

大规模生产imsEV和其治疗机制示意图。作为mRNA的递送工具，使用纳秒电穿孔(nsEP)系统生成imsEV，并同时加载抗CD71、抗PD-L1和IFN-γ的 mRNA，用于GBM的治疗

为了制备imsEVs用于GBM的免疫治疗，首先构建了一个稳定表达CD64-DsRed（CD64-DsRed+）的MEF细胞系。使CD64表达于我们生产的sEVs的表面，并确认CD64的N-端定位于这些sEVs的外部表面。为了实现目标 mRNA 主动加载到 sEV 中，我们利用了 N 肽，它能特异性地结合 RNA 中的 box B 序列。我们将 N 肽克隆到 CD64 蛋白的 C 末端（最后位于 sEV 内部），同时通过工程化IFN-γ 质粒，将box B 序列整合到IFN-γ mRNA 的 3' 端。简而言之，融合到 CD64  C 末端的 N 肽能够特异性结合box B 序列，将 IFN-γ mRNA 募集到 sEV 中。然后，将box B-IFN-γ或对照IFN-γ转染到稳定表达CD64-N肽的MEF中，并通过RT-qPCR分析收集分泌的sEV中的mRNA。后续的实验结果也验证了该主动装载策略实现募集特定mRNA进入imsEV。利用CD64（Fcγ受体）可以结合IgG重链的恒定区。随后将抗CD71（GBM靶向）和抗PD-L1（免疫疗法）抗体与sEVs分别共孵育，达到将其附着到imsEVs的表面，以使其能够特异性地靶向GBM，产生免疫治疗效果。

通过溶血毒性实验以及小鼠生物安全性和生物相容性实验，验证了这些imsEV在体内给药的安全性问题之后。作者选择GBM作为临床前模型系统，用于研究imsEV在体内的免疫治疗潜力。GBM是一种侵袭性肿瘤，目前没有有效的治疗方法，并且对免疫治疗没有反应。另一个主要障碍是肿瘤表面的MHC-I蛋白下调所导致的抗原呈递不良。低突变载量，相应的浸润性T细胞和M1巨噬细胞很少，加剧了MHC-I的下调，形成了高度免疫抑制的肿瘤微环境。

组织分布分析表明，imsEV在肝脏蓄积低的情况下显示出更高的脑靶向性

将5×10¹¹的imsEV剂量静脉注射到植入GL261肿瘤的具有免疫能力小鼠中，这些肿瘤具有适当的免疫原性。体内成像系统（IVIS）的结果显示，与非靶向sEV相比，注射后2和4小时肿瘤内 imsEV 的积累显着增加，肝脏积累相应减少，结果表明imsEV具有显著的肿瘤靶向能力。

imsEV治疗延长了GL261胶质瘤小鼠的生存期

作者继续研究了其在原位SB28小鼠GBM模型中的抗肿瘤作用，该模型由于其固有MHC-I低表达，并且表型与人GBM相似。与在GL261模型中的观察的结果类似，imsEV在SB28肿瘤中的积累程度比非靶向sEVs更高，在imsEV治疗后肿瘤生长也大大减少了，生存时间得到了延长（imsEV治疗组的中位生存时间为50天，而PBS治疗组的中位生存时间为27天）。