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EAD Talk | 声音专栏：庖丁解牛，看EAD解析脂质精细结构(1)

来源：SCIEX 分类：应用方案 2024-05-09 15:23:11 13阅读次数

Hey，大家好，我是您的质谱应用专家刘婷，20年的一线应用经验，让我深感到质谱应用信息共享的重要性。无论是质谱前沿技术，还是常用技术的深入应用，都希望在我的这个专栏中能和大家分享。“婷视角，看分析“希望拓宽您的视野，进入美妙的的质谱应用世界。

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大家好，我们又见面了。上二期内容，大家了解了EAD的研发背景、工作原理和在大、小分子碎裂上的特点，EAD的断裂位点往往和CID的断裂位点不同，所以两者具有互补性。后期内容我们将从实际的应用场景出发，看看EAD在脂质精细结构、生物药、蛋白组学和药物研究上的应用；本期内容我们先从脂质精细结构表征，看EAD应用。

本期内容

脂质作为生命基本物质，参与很多生物途径，不同于氨基酸、糖等生物分子，脂质分子的同分异构体现象更为普遍。近20年来，伴随着质谱技术的快速发展，脂质组学鉴定和定量经历了一个高速发展过程，但准确描述脂质精细结构，如：甘油/鞘氨醇骨架、酰基位点、酰基脂肪酸双键位点等，因传统的CID（碰撞诱导解离）技术并不能解决，长期以来一直是分析化学家努力攻克的难题。

对脂质精细结构表征，需要获得5个信息¹，以图1的磷脂为例说明，（1）磷脂类别信息，即头基信息；（2）酰基取代基与脂质骨架，即甘油和鞘氨醇骨架信息；（3）酰基链异构体位置，即Sn1、Sn2异构信息；（4）酰基脂肪链C=C双键位点信息；（5）双键位点的顺反异构信息。

图1. 磷脂为例说明脂质精细结构表征要求的5个信息

CID技术在脂质精细结构鉴定中，仅能完成（1）-（2）的鉴定工作，即可以确认头基类别和判断酰基取代基。但因为正、负离子碎片的特殊性，需要在正离子模式下确认磷脂类别，在负离子模式下确认酰基取代脂肪链的链长和不饱和度，复合信息才能完成工作。EAD技术大大拓展了脂质精细结构表征，可以仅在正离子采集模式下，获得（1）-（5）的MS/MS信息，这也使得脂质精细结构表征成为EAD技术最成功的应用领域之一。

要解析脂质精准结构，需要调整EAD的KE>=10eV，进入EIEIO模式。我们使用POPC（PC 16:0 / 18:1(n-9, cis)，磷脂酰胆碱）为例说明EIEIO MS/MS谱图如何表征脂质精细结构的5个信息。从图2 EIEIO的MS/MS谱图可看出：

(1). m/z 184是PC头基的表征碎片;

(2). m/z 224和m/z 226为磷脂酰胆碱PC的甘油骨架特征碎片；若是鞘氨醇骨架的鞘磷脂SM，其特征碎片为m/z 225 （图3）；

(3). m/z 491是C1-C2断裂的特征碎片，表征Sn2位点的酰基脂肪链为FA18:1；

(4). 从图4中可以看出，横坐标m/z 510-760的区域主要表征脂肪链C=C双键位点，从第一个与母离子[POPC+H-CH3]⁺相差-15Da的EIEIO碎片离子开始，会发现一系列相差CH2 (14.014 Da)的碎片离子，对于不饱和PC，由于C=C双键位点很难断，故该位点的碎片离子强度明显衰减，且在其邻近位置的单键断裂碎片强度较高；所以在EIEIO MS/MS谱图中，碳碳双键位置呈现出独特的V型强度分布，利用这一特点可以准确鉴定脂质双键位点²；

(5). 从图5 A中可以看出³，PC 16:1(n-7,cis)/16:1(n-7,cis)和PC 16:1(n-7,trans)/16:1(n-7,trans)在n-7位互为顺、反异构体，EIEIO技术将双键n-7位前后n-6和n-8位的C-C单键断裂，形成 m/z 645.442和m/z 619.426的自由基离子（Radical），由于顺反异构的构像差异，导致这两个自由基碎片与其+/-H碎片的丰度比产生差异，科学家就利用这种差异，通过公式，放大不同KE下的丰度比值（图5 B），应用于实际样品中双键顺反式的判断。

图2. EIEIO MS/MS谱图表征 POPC 精细结构，包括头基信息，脂质骨架，酰基链异构，脂肪链双键位点，双键顺反信息.

图3. EIEIO MS/MS谱图表征 PC和SM的甘油骨架与鞘氨醇骨架

图4. POPC酰基位点和双键位点表征，m/z 491是Sn2 18:1的特征碎片，n=9位双键位点表征¹.

图5. (A) PC 16:1(n-7,cis)/16:1(n-7,cis) 和PC 16:1(n-7,trans)/16:1(n-7,trans) 顺反异构体在EIEO模式下，双键n-7前后n-6和n-8位置C-C断裂产生自由基和其+/-H丰度比存在明显差异；（B）按公式计算出n-6位C-C断裂自由基碎片与其-H碎片、在不同KE能量下，顺、反式异构体的D值，可看出顺反异构的D值存在明显差异（左）；使用4种顺反异构标准品成功验证公式的可行性（右）³.

查找近10年EIEIO技术表征脂质精细结构的文章，可以发现EIEIO技术被报道应用于多种生物样本的脂质结构表征中，如：鸡蛋、牛心提取物、猪脑提取物等基质。解析脂质的精细结构，其重要意义就在于：脂质结构相关的生物学意义也就能被进一步探索和发现^1,2,3,4。

听了上面的内容，相信大家已经对脂质精细结构表征所需的5个信息和EAD技术在其中的作用，有了一定的理解。本期内容，配图较多，希望大家结合配图去了解EAD结构断裂位点，事半功倍！最后，我们来总结一下本期的内容：

脂质精细结构表征需要5方面信息，但传统CID技术仅能满足（1）-（2）信息的获取；

EIEIO MS/MS信息可以仅在正离子采集模式下，提供脂质精细结构表征所需的5方面信息；对脂质结构完整表征；

本期的主要内容，就到这里了。后面2期内容，我们将继续介绍EAD技术在脂质精细结构表征中的应用。

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参考文献

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1. J. Larry Campbell and Takashi Baba. Near-Complete Structural Characterization of Phosphatidylcholines Using Electron Impact Excitation of Ions from Organics. [J]. Anal. Chem. 2015, 87, 5837?5845.

2. Takashi Baba, J. Larry Campbell, J. C. Yves Le Blanc, and Paul R. S. Baker. Structural identification of triacylglycerol isomers using electron impact excitation of ions from organics (EIEIO) [J]. Journal of Lipid Research, Vol 57, 2016, 11, 2015-2027.

3. Takashi Baba, J Larry Campbell, J.C. Yves Le Blanc, and Paul R. S. Baker. Distinguishing Cis and Trans Isomers in Intact Complex lipids using Electron Impact Excitation of Ions from Organics (EIEIO) Mass Spectrometry. [J]. Anal. Chem. 2017, 89, 14, 7307–7315.

4. Takashi Baba, J. Larry Campbell, J. C. Yves Le Blanc, and Paul R. S. Baker. In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry [J]. Journal of Lipid Research, Vol 57, 2016, 5, 858-867.

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