30年经验积累，一文总结IP/coIP/pull-down实验攻略-医疗器械网

30年经验积累，一文总结IP/coIP/pull-down实验攻略

来源：赛默飞世尔科技生命科学产品分类：工作原理 2024-05-13 17:45:10 18阅读次数

实验室新手村：开题报告已提交，转眼1个月过去了，实验还是一头雾水，为啥我的co-IP拉不下来蛋白？

打怪升级的师兄：我当初正好相反，条带那叫一个深，结果是拉下来的蛋白被抗体条带覆盖住了，想换个抗体太不好找，无奈换了个蛋白，还好后面挺顺利。

装备丰富的大师兄：蛋白喜欢组队在细胞里干活，IP、co-IP又是常用的研究相互作用的手段，掌握好这个工具还是很重要的，总不能随随便便就换个蛋白。

但是：从实验设计，试剂选择，要遇到问题进行分析调整，每一步都不轻松，那要怎么快速掌握这项实验，轻松搞定各种疑难杂症呢？

我们依据三十多年的IP/co-IP实验经验，总结了一线技术支持常被问到的问题，希望这篇纯干货能帮助大家顺利从新手村升级，积累丰富的经验，早日驾驭IP、co-IP。

选IP、co-IP还是pull-down？

IP(Immunoprecipitation)，免疫沉淀：是利用固定在磁珠或琼脂糖树脂等基质上的特异性抗体对抗原进行小型亲和纯化的一种方法

Co-IP(co-Immunoprecipitation)，免疫共沉淀： co-IP是一种常用的鉴定蛋白-蛋白相互作用的方法，其基本实验流程和IP类似，通过使用诱饵蛋白（IP中的抗原，bait protein）特异性抗体间接捕获与其结合的靶蛋白（prey protein）。

Pull-down：另外一种进行蛋白-蛋白相互作用研究的方法，针对无法找到可用的抗体的靶蛋白。可以采用一个表位标记标记蛋白质（可在细胞内组成型表达），将其固定在基质上获得互作蛋白。很多蛋白质由于无法找到可用的抗体而无法进行免疫沉淀。

实验设计

常用行话

以上示例图证明了EDR1和EDR4有相互作用。如果想要设计好实验，先清楚以下常用“黑话”含义。

阳性对照：证实细胞裂解物中确实存在靶蛋白（IP）或者互作蛋白对（co-IP，比如诱饵蛋白X和靶蛋白Y），即为常说的input。可直接取抽好的蛋白溶液进行Western。

阴性对照：用来排除假阳性。IP/co-IP 后靶蛋白或者互作蛋白对都检测到了，固然是值得高兴的，但是这结果是不是假阳性呢？还得做个阴性对照。阴性对照如何设置呢？考虑到整个实验体系会出现beads、抗X抗体、诱饵蛋白X、靶蛋白Y（co-IP）：

*注意：总蛋白上样量过多也会造成非特异性结合，建议上样量为500ug-1mg。上样之前一定要先用BCA定个量！定个量！定个量！

pre-clear：上样前先用裂解液过一遍柱子，减少基质本身对蛋白的吸附。

Output：在某些co-IP实验中，实验人员会把IP后的上清分别进行诱饵蛋白X和靶蛋白Y的WB检测，该对照组称为output组。

内源性co-IP实验，如果最终结果为阳性，则可以证明两个蛋白之间存在相互作用；但是结果为阴性，是否两个蛋白就一定不发生相互作用了了呢？也不一定。有可能是两个蛋白是弱相互作用力，这时候可能需要交联剂协助，锁定强化弱互作蛋白；也有可能是内源蛋白表达量低，可先做过表达co-IP作为对照。

孵育（结合）顺序与孵育条件

抗体，裂解液，beads，如何排列组合？会有怎样的影响？

从以上三个结果可以看到，第一种孵育方法抗原得率最高，第三种抗原得率最低。如果靶蛋白丰度较高，第一种和第二种差别并不显著。注意，整个体系选择同样的孵育顺序，以确保结果的重复性。

试剂选择：选择切合实验需求的高性价比试剂

抗体——选经过IP验证的抗体，减少假阳性概率

抗体结合蛋白——蛋白 A, 蛋白 G, 蛋白 A/G, 蛋白 L?

快速总结版：省事且通用可选择蛋白A/G

捕获填料—琼脂糖还是磁珠？

快速总结版：

详细对比信息如下：

DIY还是试剂盒？

快速总结版：

各种buffer

整个co-IP系统，涉及到裂解液，结合液，洗涤液，洗脱液，这4种溶液要如何考量呢？

裂解液——样本质量很大程度受限于裂解液，要考虑其中的去垢剂种类。

非变性裂解液，含有非离子型去垢剂，有助于稳定天然蛋白构象，比如IP lysis buffer。不建议使用变性裂解液，比如RIPA，虽然裂解剧烈，但是无法维持蛋白天然构象，会破坏互作蛋白对。
如果自配，建议采用温和系统，比如NP40/Triton 0.1%-1%；SDS ≤0.1%，盐离子≤150mM
记得要加蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂

结合液——利于蛋白之间的相互结合，要考虑孵育（结合）顺序