样品为NIST 1950标准血浆，加入Avanti公司的Ultimate SPLASH的69钟脂质作为内标。采用nano液相系统进行脂质的分离，流速为200 nL/min。质谱采集条件采用仪器内置的脂质实时谱库搜索工作流程。实时谱库搜索与数据采集同步进行，一级全扫描采用24万分辨率进行采集，在采集HCD MS²的谱图时，所得到的前体离子的质荷比和谱图将实时搜索建立的谱图库，并根据相似度评分作出决策。若评分超过阈值，将继续进行下一步的MS² CID或MS³ CID。这一流程可以非常方便的自定义，并可以在一次进样中实现脂质的精细结构解析。

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作者采用氘代内标脂质来研究PC、PE、PG、PI、PS和SM脂质的采集极性以及MS/MS的碎裂规律。研究结果显示，大部分脂质在正离子模式下具有更好的响应，而TG类和CE类在负离子模式下没有响应。基于这些结果，作者选择采用正离子模式进行脂质的分析。

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PC和SM这两类脂质可以通过母离子的精确质量数进行区分。在MS/MS谱图中，都具有m/z 184.073的磷酸胆碱的特征离子。对于PC类脂质，随后的CID碎裂会产生与脂酰链相关的碎片离子，例如LysoPC17:0、LysoPC18:1以及相应的脱水峰。而对于SM类脂质，MS/MS谱图中会产生与脱水和胆碱头基相对应的特征离子。要在分子水平上鉴定鞘磷脂，需要对脱三甲胺峰后的MS3级质谱进行进一步确定（例如d18:1）。这些特征离子和碎片离子为PC和SM类脂质的精细结构鉴定提供了重要的信息和依据。

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对于PE、PG、PI和PS类脂质，MS²谱图中会产生与各类头基相应的中性丢失峰。通过MS³质谱分析，可以获得各个脂质相应的脂酰链碎片离子及中性丢失峰。这一分析策略可以帮助我们更好地理解和研究这些类脂质的结构与功能。

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基于上述脂质碎裂谱图和规律，作者建立了一个标准品谱图数据库。在Orbitrap Ascend平台上，作者利用这个数据库结合实时谱库搜索功能来改善正离子模式下磷脂的表征。首先，采集全扫描谱图和DDA模式下的MS²谱图。此时，软件将母离子的质荷比、保留时间和生成的碎片谱图发送到RTLS节点进行搜索，并返回搜索结果。如果实时谱图匹配可以与谱图数据库进行匹配，并且得分超过设定的阈值，将触发与脂质种类相关的MSⁿ扫描。如果谱图匹配得分较低，或者无法与数据库相匹配，软件将继续按照标准的DDA进行下一步的采集。

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整个搜索过程非常迅速。作者通过改变母离子容许质量偏差从5到500 ppm来模拟RTLS搜索时间对搜索空间的影响。在使用 ±10 ppm的母离子质量偏差进行搜索时，平均搜索时间不到1毫秒。文章中建议将PC和SM类脂质的阈值设定为≥90分，而其他脂质的阈值设定为≥60分，以满足实验需求。典型的分析流程如下图所示，其中SM类脂质通过两轮RTLS搜索，而PC和其他脂质则通过一轮RTLS搜索。通过MS²或MS³级的碎裂，可以获得特征脂酰链的碎片离子，为脂质的精细结构解析提供了有力的数据支持。

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实时谱图搜索是一种非常有用的工具，可以为精细结构解析提供强大的支持，并提高鉴定结果的准确性。以m/z=787.667的脂质为例，通过MS/MS谱图获得了质荷比为184的碎片离子，该离子对应于磷酸胆碱的极性头部基团，实时谱图搜索的打分为98.6，这些信息足以将该脂质鉴定为SM d40:1。这个结果触发了MS²扫描，进一步获得了质荷比为770和711的碎片峰。随后，对中性损失峰进行了MS³分析，产生了d16:1和d18:1对应的碎片离子。经过最终的数据分析，发现m/z 787.667由两种脂质构成，分别是SM d18:1/22:0和SM d16:1/24:0的共流出脂质。这一结果进一步展示了实时谱图搜索在脂质鉴定中的重要性，为我们对复杂脂质结构的解析提供了有力的帮助，有助于我们更好地理解和研究脂质的结构和功能。

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相比于仅基于特征离子触发的方法，RTLS方法触发了更具选择性的MSⁿ，并且与目标脂质的保留时间更为接近。这种更精确的触发方式减少了冗余数据，提高了低丰度脂质触发MS/MS的可能性，从而显著提升了脂质鉴定的深度和准确性。这一研究为脂质分析提供了一种高效且可靠的方法，为进一步研究复杂脂质的结构和功能提供了有力的支持。

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使用LipiDex软件对数据进行分析后，总共注释了965个脂质特征。其中，217个脂质在精细结构水平上得到了解析。如果只考虑MSⁿ目标类别（PC、PE、PG、PI、PS和SM），负离子模式下获得了最多的精细结构解析数量。然而，当考虑所有脂质时，RTLS方法提升了正离子模式DDA方法的分析深度，并增加了分子层次脂质注释的数量。

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将实时谱库搜索技术与多级碎裂技术相结合应用于单一极性的脂质分析非常有价值，可以在不需要极性切换的情况下提供详细的结构信息，而且不需要更多时间来采集不同极性的数据。作者通过建立的实时谱库搜索功能，与传统的DDA触发模式相比， RTLS触发的MSⁿ采集方法具有更高的选择性，可以节省宝贵的循环时间来采集低丰度脂质。这些研究结果为脂质分析提供了新的方法和策略，有助于更深入地理解和研究脂质的结构和功能，推动脂质研究的发展。