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显微课堂 | 对性侵证据中的精子进行法医检测

来源：徕卡显微系统(上海)贸易有限公司分类：动态 2023-10-30 16:41:29 2阅读次数

现代科学方法对于犯罪现场证据分析的影响为法医学的多个子领域带来了极大的改变。最为引人注目的一个例子或许就是分子生物学对于生物证据分析的影响。处理生物证据并生成DNA图谱所需的技术并不在本文的讨论范围之内，但这项工作需要一些令人印象深刻的观察设备，包括闪光灯、计算机接口，以及机械臂。不过，所有这些技术都在某种程度上掩盖了这样一个事实：筛选生物证据的方法和程序在过去四十年基本没有任何变化，尽管这是寻找最佳证据进行DNA分析的必要前提。

法医学实验室的工作人员非常清楚，DNA分析的整个结构始于从证物或证据拭子分析中识别可疑的污渍。出于犯罪学和实验室程序方面的原因，必须确定用于DNA分析处理的生物材料的来源，例如来自血液、唾液、精液或精子。由于法医学生物实验室有整整一半的工作涉及性侵证据，因此精液和精子的鉴定尤为重要。请记住，精子是一种具有独特形态的特殊细胞，也是人类精液中绝大多数含DNA细胞的来源。

一旦在性侵证据中鉴定出精液，DNA分析人员不仅必须尝试确定是否存在精子，还要确定哪项证据或拭子中的精子最多，以便找出最有可能生成DNA图谱的样品。同样的，相关的法医学方法四十年来也没有改变，目前的精子法医鉴定采取通用细胞染色方法搭配明场显微镜。理论上，这应该足以发现精子，但实际工作中，从性侵证据中分离出来的精子已经失去许多进行形态学识别依赖的独特亚细胞器。因此，DNA分析师必须花费大量时间使用不够理想的显微技术来寻找精子。

为了提供更科学、更程序化的精子搜索技术，Independent Forensics开发了一种基于荧光单克隆抗体的试剂盒SPERM HY-LITER，用于对性侵证据中的精子进行微观鉴定。SPERM HY-LITER经过特别设计，使用以Alexa 488荧光基团实现化学标记的独特单克隆抗体对精子进行阳性识别。该试剂盒含有第二种荧光染料：4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），可对所有细胞核进行染色；这是目前大多数DNA法医学实验室使用的KPIC染色剂的荧光类似物。通过结合两种荧光染料，SPERM HY-LITER为精子的识别提供了几个视觉确认步骤。精子可以在荧光素通道中可视化（Alexa 488的荧光光谱明显落在荧光素的发射光最大值范围内）；DAPI通道可以显示所有细胞核；而使用专门的双“滤光块”，可以同时观察到上皮细胞核和精子。

SPERM HY-LITER中使用的单克隆抗体具备前所未有的特异性，可以从以前无法检查的样本中识别出人类精子。此外，相比目前的明场显微镜技术，荧光显微镜具有信噪比优势（以及完全优化候的SPERM HYLITER?套件的背景噪点非常低），可将精子检测的灵敏度提高几个数量级。DAPI和Alexa染料的搭配组合专为图像处理软件而设计，这样精子识别就能从基本上实现自动化。使用计算机辅助图像分析软件，首先可以扫描SPERM HY-LITER?染色剂的“特征”，即背景上的荧光信号，然后进一步分析这些特征，以确定观察到的荧光颜色（或色调）。只有同时具有DAPI（来自DNA）和Alexa 488（来自单克隆抗体）荧光的特征才会被软件认定为精子。

SPERM HY-LITER以预校准滴管瓶，提供载玻片染色所需的全部解决方案——两个略有不同的版本允许对涂片载玻片（通常包含在性侵证据套件“强奸套件”中）或由证据拭子或已识别污渍制成的提取物进行染色。尽管并非必须，但在该方法中增加相差功能，可以让经验不足的实验室人员在一张图像中视觉呈现细胞、细胞核和精子。

为了说明SPERM HY-LITER方法的特异性和敏感度，我们展示了使用SPERM HY-LITER?染色的不同品种动物的精子混合物（含或不含人类精子）（图1）。

图1：犬、猫、牛、马、山羊、绵羊、猪、鼠的混合物（左图）和犬、猫、牛、马、山羊、绵羊、猪、鼠和人类精子的混合物（右图）采用SPERM HY-LITER?染色，并借助相差、DAPI、荧光素滤光片（分别为顶部、中间和底部）进行可视化。请注意，在荧光素通道中只有含人类精子的混合物受到标记，从而证明了SPERM HY-LITER?染色方法的物种特异性。显微照片在配备A4和L5滤光片的Leica DM2500显微镜上拍摄。最终放大倍数：400X

SPERM HY-LITER的犯罪实验室案例工作验证研究所拍摄的图像证明了SPERM HY-LITER的敏感度和细胞类型特异性（图2）。此处，性侵案件护士检查员使用SPERM HY-LITER?对从性侵受害者身上采集的阴道拭子制作的涂片载玻片进行染色。众所周知，这些类型的载玻片对于犯罪实验室人员来说很难分析是否存在精子，因为细胞密度、采集方法和储存条件都会破坏精子的细胞形态并抑制KPIC染色，导致标准精子鉴定方法几乎无效。这里的一系列图像展示了原始载玻片的复杂性（参见相差图像），在制备过程中检测精子的能力（参见相差和FITC组合图像），以及能够同时识别上皮细胞和精子细胞的过程中的确认步骤（参见双滤光块和相差组合图像）。SPERM HY-LITER?会对截面的所有层中的精子进行染色。

图2：法医学DNA犯罪实验室对性侵案件的涂片载玻片进行SPERM HY-LITER?染色。依照SPERM HY-LITER?的现成方案对涂片载玻片进行染色。使用PAX-IT 2相机，以及DAPI、FITC和DAPI/FITC双滤光块，拍摄的显微照片。注意图像顶部的气泡。

法医分析师的职责通常涉及筛选案件中的众多证据。尽管目前的法医学实验室检测方案有所不同，但精子筛查通常使用40倍物镜（400倍最终放大倍率）。同样的，SPERM HY-LITER在这方面明显优于当前方案，因为可以使用10倍和20倍物镜（100倍和200倍最终放大倍率）轻松实现染色制剂的可视化，进而大幅增加视野，从而减少扫描染色载玻片所需的时间。事实上，来自SPERM HY-LITER?染色载玻片的信号让适当配置的荧光立体显微镜就足以扫描到精子（图3）！这类立体显微镜只需配备传统的汞光源或更新的光纤金属弧光灯，并且兼容与传统荧光复合显微镜相同的滤光块。考虑到这些仪器的视野范围和工作距离（以及在立体显微镜上操作载玻片带来的速度和便捷），这种方法有望彻底改变犯罪实验室从性侵证据中寻找精子的方式。