【点播课程】采用单损耗激光的五色FLIM-STED显微镜
内容涉及使用单一损耗激光和荧光寿命phasor分离技术的五色STED技术。
受激发射损耗 (STED)显微镜通过激发一个受衍射限制的体积，然后用STED激光器抑制其外部的荧光，实现超分辨率。
STED激光器和荧光基团的选择取决于后者的光谱特征。对于多色分析，优选一个STED波长，但会限制可使用的光谱通道的数量。为了进一步提高可区分的荧光基团的数量，除了光谱信息外，还可以利用它们的荧光寿命。一个挑战是找到合适的荧光基团组合，因为荧光寿命信息通常不可用。
学习要点
在STED显微镜中使用单个STED激光器的优势
使用单STED激光器进行五色FLIM-STED成像
利用荧光寿命来扩展共聚焦和STED多色成像应用中可用荧光基团数量的可能性。
可以区分的颜色数量翻倍
利用培养细胞、常见染色方案以及市售荧光基团和显微镜，我们发现通过基于phasor的荧光寿命成像显微镜 (FLIM)可分离出两个具有相似发射光谱但荧光寿命不同的荧光基团，从而增加STED或共聚焦显微镜中荧光基团的数量。
在我们的多色FLIM-STED方法中，近红光通道激发波长594nm，发射波长600-630nm)和远红光通道 (激发波长633nm，发射波长641-680nm)中的两个荧光基团以及一个进一步红移荧光基团(激发波长670nm，发射波长701-750nm)均用单一激光 (775nm)进行激发。基于phasor图的分析提供了一种简单、快速的方法来可视化染色质量、荧光基团的寿命以及进行简单混合的工具。我们还提供证据表明，如果能够找到合适的荧光基团，使用单一损耗激光进行八色FLIM-STED是可行的，同时证实了荧光基团在不同的耦合分子中可能具有不同的寿命。
总的来说，这种方法将激光扫描显微镜中可区分的颜色数量增加了一倍。基于phasor的分析简化了整个程序，使得大量科学家在经过短期培训后就能使用。
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