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【微课堂】泰林过氧化氢灭菌生物指示剂芽孢计数方法

来源：浙江泰林生物技术股份有限公司分类：新品 2023-11-29 14:20:32 9阅读次数

《药品GMP指南》生物指示剂的应用中指出，实验室在接受商品化生物指示剂时，应进行微生物数量测定。

那么过氧化氢灭菌生物指示剂的芽孢数量是如何确定的呢？接下来我们就为大家分享过氧化氢灭菌生物指示剂芽孢计数的具体操作方法。

过氧化氢灭菌生物指示剂芽孢计数

—操作方法

随机抽取需检验批次生物指示剂 4片（支）与相关物品一并放入安全柜中，用酒精棉擦拭外表面，通风15min以上，后续操作如下：

特别提醒：不可将指示剂进行紫外照射，否则会造成计数结果偏低！！！

01芽孢洗脱

在生物安全柜中，取出生物指示剂载体，分别放置于无菌试管中，向试管中加入 10 mL无菌纯化水，于涡旋混匀仪上震荡2min，转移至超声波清洗机中，设置频率为40KHz，处理15min，将该试管记为10^-1。

特别提醒：不要将多片载体放置到一个容器中进行洗脱，载体相互堆叠可能影响洗脱效果，造成计数结果偏低！！！

02热激活处理

将试管放入95～100℃水浴锅中热激15min；结束后立即放入 0～4℃冰水混合浴中冷却至室温。

03梯度稀释

将热激后10^-1试管转移至生物安全柜中，于涡旋混匀仪上震荡30s，用移液枪吸取1mL菌悬液，加入到另一支含有9mL无菌纯化水试管中震荡30s，记为10^-2。按照此方法依次稀释至10^-3、10^-4（稀释级别按制造商提供的芽孢数量而定）。

取10^-4稀释倍数的试管（理论芽孢浓度在30~300cfu/mL范围内），用移液枪吸取1mL稀释液，置90mm的无菌平皿中，注入15 ~20mL温度不超过45 ℃融化的胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA），混匀，同一稀释级制备两个平板。

等待琼脂凝固后，倒置于培养箱中55~60℃培养48h后分别点记两个平板的菌落数，并计算两个平板的平均菌落数。

04计算

指示剂芽孢数cfu/片（支）=平板上的平均菌落数cfu×N

注：N为对应的稀释倍数。

05判定标准

平板上菌落应呈白色或黄色、边缘整齐、表面光滑有光泽、圆形凸起，无杂菌。计数结果在产品标定值的50%～300%范围内。

注意事项

上述方法适用于泰林不锈钢载体的过氧化氢灭菌生物指示剂芽孢计数（片式/自含式）。生物指示剂芽孢计数过程中，可能由于人员、计数方法、实验材料、仪器设备、环境等因素，造成计数结果不准确。

我司研究结果表明，稀释液会对计数结果产生影响，如使用0.1%蛋白胨水溶液、含0.05%吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液、含0.05%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液时，芽孢计数结果偏低；如在计数操作过程中未对产品进行超声洗脱，也会导致芽孢计数结果偏低。

GB18281.1要求，在生物指示剂有效期内，用户或第三方机构使用制造商给出的方法所检测出活菌的数量，应介于生物指示剂产品标定值的50%～300%之间。此外，根据ISO 11138-7要求，在验证生物指示剂含菌量时，用户应遵循制造商所提供方法和材料的建议，因为方法和材料的差异可能对结果有重大影响。

关于我们

TAILIN

泰林专注微生物检测与控制30年，经过长期的开发与测试，现已推出湿热灭菌生物指示剂、过氧化氢灭菌生物指示剂、环氧乙烷灭菌生物指示剂、干热灭菌生物指示剂等，可接受不同含菌量的产品订制，协助客户完成不同灭菌工艺的验证。

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