1.1牛奶

称取2g牛奶于50mL离心管中，加入15mL1%的三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超声10min，振荡10min，10000r/min离心10min，转移上清液到25mL容量瓶中，用1%的三氯乙酸溶液定容至25mL。准确移取5mL样液，加入5mL水混匀后做待净化液。

备注：①过滤纸容易造成损失；

②若样液稍微浑浊，可以考虑再次离心，避免上样过程中堵柱子。

1.2奶粉

称取2g奶粉于50mL离心管中，加入10mL1%的三氯乙酸溶液，5mL乙腈和2mL 5%的醋酸铅溶液，超声10min，振荡10min，10000r/min离心10min，转移上清液到25mL容量瓶中。残渣再加入6mL1%的三氯乙酸溶液，振荡10min进行二次提取，10000r/min离心10min，合并2次提取液，用1%的三氯乙酸溶液定容至25mL。准确移取5mL样液，加入5mL水混匀后做待净化液。

备注：①过滤纸容易造成损失；

②提取次数会影响回收率；

③若样液浑浊，可以考虑再次离心，避免上样过程中堵柱子。

活化：使用前依次用3mL甲醇、5mL水活化柱子；

上样：将待净化液转移至固相萃取柱中；

淋洗：依次用3mL水、3mL甲醇洗涤；

洗脱：用6mL5%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液。

重新溶解：洗脱液于50℃下氮气吹干，残留物用1mL流动相复溶，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。

备注：整个固相萃取过程建议自然滴落，若加压控制流速不超过1mL/min。

设备：液相色谱仪；

色谱柱：CommaSil?C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；

检测器：紫外检测器；

检测波长：240nm；

流动相：A:离子对试剂缓冲液（准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约980mL水溶解，调节PH至3.0后，定容至1L备用）；B:乙腈；

洗脱方式：等度洗脱，A:B=90:10；

柱温：30℃；

进样体积：20μL；

流速：1mL/min。

4.1测定谱图

图1 曲线浓度点为1μg/mL的三聚氰胺液相色谱图

图2：添加浓度为2mg/kg牛奶中三聚氰胺的液相色谱图

图3：添加浓度为2mg/kg奶粉中三聚氰胺的液相色谱图

4.2实验结果

表1 2mg/kg纯牛奶基质中三聚氰胺的添加回收结果

表2 2mg/kg奶粉基质中三聚氰胺的添加回收结果

5.1 过滤纸的损失

选择牛奶样品，添加水平为2mg/kg考察过滤纸对回收率的影响。

方法1：严格按照GB/T 22388-2008标准处理：样液经三氯乙酸溶液湿润的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL。

方法2：提取结束后，上清液到25mL容量瓶中，直接用三氯乙酸溶液定容至25mL。

方法1和方法2的差别在于是否过滤纸，其它步骤均一致，由测试结果可以看出，样液经滤纸过滤后会存在一定的损失。测试结果如下：

表3 考察过滤纸对回收率的影响

5.2 提取次数

在实验过程中发现对于牛奶样品，一次提取就能提取充分；而对于奶粉样品，提取次数会影响回收率，提取2次才能提取充分。从5.1可以知道过滤纸会有一定的损失，因此在验证提取次数因素时选择不过滤纸。

选择普通奶粉作为样品，添加水平为2mg/kg考察提取次数对回收率的影响。

方法1（提取1次）：称取2g牛奶于50mL离心管中，加入15mL1%的三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超声10min，振荡10min，10000r/min离心10min，转移上清液到25mL容量瓶中，用1%的三氯乙酸溶液定容至25mL。其余步骤与标准一致。

方法2（提取2次）：称取2g奶粉于50mL离心管中，加入10mL1%的三氯乙酸溶液，5mL乙腈和2mL 5%的醋酸铅溶液，超声10min，振荡10min，10000r/min离心10min，转移上清液到25mL容量瓶中。残渣再加入6mL1%的三氯乙酸溶液，振荡10min进行二次提取，10000r/min离心10min，合并2次提取液，用1%的三氯乙酸溶液定容至25mL。其余步骤与标准一致。测试结果如下：

表4 考察提取次数对回收率的影响

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