科普 | 荧光对拉曼光谱技术的影响以及应对手段
拉曼光谱技术是一种分析物质结构和成分的非侵入性技术。通过照射样品并测量其散射光的频移，可以获得物质的拉曼光谱图。这种技术可以用于化学品、生物样品、纳米材料等的快速分析。它具有高灵敏度、无需样品处理等优点，可广泛应用于材料科学、生命科学、环境监测等领域。
拉曼光谱的应用十分广泛，但是同时拉曼检测还会受到许多的限制。当物质收到激发光照射时，除了待检测的拉曼散光光外，还有比拉曼光强许多的锐利散射光，同时还有可能存在荧光。
拉曼光谱技术背后的物理机制是拉曼散射。当用一定频率的激发光照射到样品时，一部分入射光子与样品分子之间发生弹性碰撞，发出弹性散射光，这种散射没有能量交换，称为瑞利散射；有一部分入射光子和样品分子发生了非弹性碰撞，产生了能量的转移，这种散射称为拉曼散射。
图1 拉曼散射以及瑞利散射能级图
除了上述发生的散射外，物质收到激光照射并吸收某些特征频率的光子后，可以由基态跃迁至第一电子激发态或高电子激发态的不同振转能级，处于电子激发态的分子通过热振动等弛豫过程降至第一电子激发态的最低能级，然后再由该最低能级向基态的各个振转能级跃迁并发出荧光。
图2 荧光散射能级图
总体来说，拉曼散射发生的概率很小，所以拉曼光强度远小于瑞利散射光和荧光的强度。瑞利散射一般比拉曼散射强上千倍，而荧光可达拉曼光强度的十的六次方到八次方倍。但由于瑞利散射光的波长和激发光波长相同，可以通过窄带带组滤光片、长通滤光片或多级单色仪装置进行滤除。但是荧光光谱范围很宽，通常是和拉曼光谱重叠在仪器，不能通过滤光片进行抑制，荧光的存在会淹没拉曼信号，导致拉曼光谱无法检测。
荧光淬灭剂
荧光猝灭剂是最传统的方法之一，该方法需要在样品中添加一定的荧光猝灭剂，利用猝灭剂分子与样品分子之间物理化学反应来降低样品分子的沂广发射强度，从而达到抑制荧光的目的。这种方法成本低，操作简便，但是加入的猝灭剂可能会影响待测样品的拉曼谱，因而应用范围受到较大的限制。
红外/紫外光激发法
由于近红外波段的光子很少能被样品分子吸收，基态电子很难被激发，因此产生荧光的可能性较小。但由于拉曼散射光的强度与波长的四次方成反比，所以用这种方法得到的拉曼散射强度很弱。785nm激光能有效避免荧光的产生，并且该波段的CCD量子效率比较高，因此用785nm作为拉曼激发光源越来越受到研究人员的青睐。
紫外光激发方法是用小于250nm的激光激发样品，由于荧光的斯托克斯位移比拉曼位移大得多，因此有荧光物质存在，也能充分区别荧光和拉曼光。紫外激发方法的一个较大局限性在于紫外光能量太高，可能导致样品分解。
荧光对拉曼光谱有干扰作用，往往会覆盖或掩盖拉曼散射信号，降低了信号质量。通过背景信号消除技术、时间解析等方法可以减少荧光对拉曼光谱的影响，提高信号的检测性能。同时，选择适当的激发波长和使用拉曼增强剂也可增强拉曼信号，克服荧光干扰，实现准确的拉曼光谱分析。
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