2023年2月24日，中国国家药品监督管理局官网最新公示，注射用德曲妥珠单抗已正式在中国获批上市。这款药物由阿斯利康和第一三共联合开发，科研代号DS-8201。截至目前，德曲妥珠单抗已在全球至少获批5项肿瘤适应证，包括两种乳腺癌。

DS-8201由抗HER2人源化单克隆抗体与载药拓扑异构酶Ⅰ抑制剂DXd（payload）通过可裂解连接子（linker）组成，其DAR值达理论最大值8，具有避免耐药、特异性强、高细胞毒性和安全性良好的特点。

对于ADC这类药物来说，DAR的测定是非常重要的关键质量属性。今天我们将为大家展示Biozen这种生物惰性的反相柱在这个重要检项上的应用案例。

小分子毒素抗体比DAR（drug-to-antibody ratio）是ADC药物独特的重要质量属性，它代表抗体偶联小分子毒性药物的平均数量。DAR值分析常见的模式为HIC，该模式下根据分子疏水性逐渐增加的顺序洗脱。荷载小分子药物最多的分子由于疏水性最强最后洗脱，分离过程类似于反相色谱。但是随着ADC药物的payload不断发展，近期科研工作者发现对于偶联较强亲水性payload的ADC药物而言，不同荷载分子之间的疏水性差异不是特别明显，HIC模式下无法很好的分离不同载药数量的ADC分子。

此时反相色谱就成为一种适合的替代方案，该方法特别适合基于半胱氨酸偶联的ADC。通过对ADC药物进行还原，使抗体还原为轻链和重链，含不同数量小分子载药数的轻链和重链依据载药数量从少到多依次洗脱。再通过计算各轻、重链的峰面积百分比，并结合每个峰偶联小分子药物的个数，计算加权平均DAR值。

本案例使用Biozen的400?孔径的WidePore C4色谱柱对DTT还原后的Trastuzumab-deruxtecan供试品进行分析，并计算其平均DAR值。

Trastuzumab-deruxtecan对照品购自第一三共，DAR值为8。用纯水稀释为浓度为1.0mg/mL；Trastuzumab-deruxtecan供试品，由客户慷慨赠送，先用纯水稀释为浓度为1.0mg/mL；再用1M DTT还原后上样。Trastuzumab购自MCE；先用纯水稀释为浓度为1.0mg/mL；再用1M DTT还原后上样。

色谱柱：Biozen WidePore C4（2.6μm，400?，150*4.6mm）；P/N：00F-4786-E0

流动相A：0.1%TFA水

流动相B：0.1%TFA乙腈

流速：0.5mL/min

柱温：60℃

波长：280nm

进样量：10μL

通过对Trastuzumab-deruxtecan供试品，Trastuzumab单抗和Trastuzumab-deruxtecan对照品进行还原（100μg蛋白中加入5μL 1M DTT，37℃分别孵育半小时和一小时），我们可以在反相色谱上通过梯度优化，清晰的分离轻链和重链以及荷载不同小分子数量的轻重链。通过对峰面积进行加权计算，我们可以计算得供试品的平均DAR值为3.98。

裸抗（蓝）、供试品（黑）和DS-8201（红）轻重链保留时间对比

反相测DAR的方案，是正交于HIC方法的很好的补充。同时，这种方法可以直接上质谱进行表征，对于含偏亲水性payload的ADC来说，也能够得到比HIC更好的分离结果。本应用使用的Biozen WidePore C4采用核壳技术结合丁基的键合相，核壳的设计不仅可以大幅提高柱效，也可以减少蛋白与固定相的次级作用，改善蛋白回收率，峰形和残留的问题；三键键合工艺能够耐受90度的高温；Bio Ti生物惰性的钛合金柱硬件也最大程度的减少了对生物样品的干扰，保证分析结果的稳健可靠。

当然，除了Biozen WidePore C4，稍长碳链的Biozen Intact XB-C8也是键合相互补的优选。特别是对于MMAE这类疏水性payload来说，可以优先尝试空间位阻填料工艺的Biozen Intact XB-C8。