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用户文章丨《Nature Microbiology》厌氧甲烷氧化菌作用机制最新研究成果

来源：长春长光辰英生物科学仪器有限公司分类：前瞻 2024-03-09 15:00:03 18阅读次数

2023年12月8日，浙江大学胡宝兰教授团队在《Nature Microbiology》（影响因子28）期刊上发表了题为“Methane-dependent complete denitrification by a single Methylomirabilis bacterium”的论文，该研究经过1000余天的富集纯化培养，成功获得了全球第一株，也是唯一一株全程反硝化型厌氧甲烷氧化菌的纯化培养物，补齐了甲烷依赖全程反硝化过程在单一生物中耦合的空白，实现了重大突破。

核心产品——PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪有幸为本研究中富集培养后的分离纯化单细胞筛选培养提供了有力工具。

一、研究背景

反硝化作用是全球氮循环中不可缺少的一部分，它将固定的氮返回到大气中。最近，甲烷被确定为反硝化的合适电子供体。通常硝酸盐和亚硝酸盐主要沉积在自然土壤环境中，深层环境土壤在厌氧分解有机物的同时产生甲烷。在土壤环境中，依赖甲烷的反硝化菌群可以减少甲烷排放，并有助于防止氮氧化物的积累。过去的研究认为，在缺氧环境中，依赖甲烷的硝酸盐和亚硝酸盐的去除被认为是ANME-2d古菌和“Candidatus methylirabilis”属细菌之间的共生作用。而本研究从硝基和甲烷的水稻土中富集纯化了一株Methylomirabilis属的新菌株Ca. Methylomirabilis sinica（Ca. M. sinica），该菌株能够独立地通过甲烷氧化将硝酸盐和亚硝酸盐还原至氮气。

二、实验方法

为探究土壤环境中厌氧甲烷依赖反硝化菌的反硝化过程，本研究从水稻土壤中提取了土壤菌，通过GLSBR系统进行了富集纯化培养，通过监测纯化培养过程中的硝酸盐和亚硝酸盐浓度变化，确定培养菌群的功能；又通过FISH和16s扩增子测序监测富集菌群的物种组成变化；通过宏基因组学测定富集培养菌的基因组特征，得到Ca. M. sinica菌在Methylomirabilis菌属中的亲缘关系；利用透射电镜、扫描电镜等方法确定Ca. M. sinica菌的形态特点以及与Methylomirabilis菌属其他菌的形态差异。在富集培养后，利用产品—PRECI SCS-R300，从中分选了多组可能具有反硝化作用的菌，并经过多次传代培养得到了纯化后的Ca. M. sinica菌。在纯化阶段利用同位素13C和15N标记确定了Ca. M. sinica菌的反硝化过程和产物，利用宏转录组学和宏蛋白组学确定了Ca. M. sinica菌反硝化过程中的基因表达情况。最后，进一步利用反硝化过程中的酶动力学验证了Ca. M. sinica菌在营养贫瘠条件下对硝酸盐的亲和性。

三、结果

1.Methylomirabilis菌属富集培养及宏基因组分析

文章提取水稻土壤菌群后，在GLSBR系统中，以厌氧、甲烷、硝酸盐等条件为限制进行了富集培养，并在富集培养过程中对系统中的菌进行了硝酸盐浓度监测（图1a），FISH（图1c-f），16s扩增子测序（图1b），宏基因组测序（图2），透射电镜扫描电镜（图3）的显微观察等监测。根据宏基因组结果筛选到了Ca. M. sinica菌，并以其显微观察的形态学特征作为分选标准对长达一年的厌氧富集培养产物进行了细胞分选，对分选后的细胞进行了长达一年的传代纯化培养，最终得到了高度纯化的"Ca. M. sinica"培养物。

图1：富集培养阶段底物浓度监测及物种组成监测。a为硝酸盐和亚硝酸盐的浓度检测，b为16s扩增子测序的Ca. M. sinica的物种占比，c-f为FISH原位杂交显示的富集纯化过程的物种变化，cd为富集初期，ef为纯化培养后（Ca. M. sinica用cy3和FITC探针标记）。

宏基因组检测结果中，获得了完整度>90%，污染度<5%的MAG359，并将其命名为Ca. M. sinica。从该菌基因组中发现了过去甲烷依赖反硝化作用全过程基因，包括编码了周质的NapAB，膜结合Nar型硝酸盐还原酶NarGHI，细胞色素cd1型亚硝酸盐还原酶NirS和推测的一氧化氮歧化酶DAMO_2434。同时，探究了该菌与其他几类Methylomirabilis菌的亲缘关系和系统发育关系（图2），发现该菌与其他Methylomirabilis属的菌亲缘关系较远，可能是一株新类型的Methylomirabilis属菌。

图2：a表示基因组系统发育关系；b表示反硝化酶NapA的亲缘关系；c表示pMMO蛋白的亲缘关系。

2.“Ca. Methylomirabilis. sinica”单细胞分选及纯化培养

透射电镜和扫描电镜结果发现（图3），Methylomirabilis属菌具有沿细胞纵向脊状的多边形形状，超微结构与Ca. M. sinica菌相似，Ca. M. sinica菌主要以细胞聚集体的形式出现，带有一些单细胞，细胞两极并未呈现明显的帽状结构。根据显微观察的形态学特征，利用PRECI SCS-R300对符合形态学特征的菌进行了分选，用于后面进一步纯化培养（图4）。

图3：ab为透射电镜显微图，cd为扫描电镜显微图。

图4：分选结果，ac为分选前图像，bd为分选后图像。

3. Ca. M. sinica菌全程反硝化过程验证及宏转录组宏蛋白组分析

为确定Ca. M. sinica菌整个甲烷依赖反硝化过程，文章从表型与基因表达两方面进行了验证。首先，通过¹³C和¹⁵N的同位素标记（¹³C标记甲烷，¹⁵N标记硝酸盐）确定反硝化过程的最终产物分别为¹³CO₂和³⁰N₂，符合最开始推测的甲烷依赖单菌反硝化公式。

图5 甲烷依赖型全程反硝化公式

值得注意的是，在此过程中并未明显检测到¹⁵N标记的亚硝酸盐的形成，这表示Ca. M. sinica菌可以独立完成甲烷依赖的直接反硝化作用，即从硝酸盐直接还原为氮气（图6），而不是硝酸盐经过还原为中间产物亚硝酸盐再转化为氮气。

图6：a为¹³CH₄到¹³CO₂的化学计量平衡转化，b为¹⁵NO₃-转化为³⁰N₂和¹⁵NO₂-的化学计量平衡，c为³⁰N₂与¹³CO₂的平均生成速率及其比值。数据以平均值±标准差(n = 3)表示。

其次，文章对富集培养和纯化培养过程中的菌群和Ca. M. sinica进行了宏转录组和宏蛋白组测序分析（图7），来确定反硝化过程中各基因的表达情况。在富集培养体系中，微生物群落对于亚硝酸盐的消耗高于对硝酸盐的消耗，而对于Ca. M. sinica纯化培养体系中，Ca. M. sinica的硝酸盐还原酶NapAB的转录水平略高于亚硝酸盐还原酶NirS的基因转录水平，这种现象并未在Methylomirabilis菌属的其他菌中观察到。

图7：a为宏转录组反硝化基因的表达情况，b为宏蛋白组反硝化基因对应的蛋白表达情况。

确定基因表达情况后，通过对纯化培养的Ca. M. sinica菌硝酸盐还原酶的动力学研究确定了Ca. M. sinica菌在营养贫瘠条件下对硝酸盐的亲和力高于亚硝酸盐。另外，文章在SRA数据库中根据Ca. M. sinica菌的16s全长检索了相似度大于95%的Methylomirabilis菌属，发现该类菌主要分布于淡水和地下水中。

四、结论

综上所述，该文章发现了一株新的Methylomirabilis属细菌（命名为“Ca. M. sinica”），它具有甲烷依赖的全程反硝化作用，能够将甲烷和硝酸盐转化为二氧化碳和氮气，主要分布于全球淡水资源中，并在营养贫瘠条件下对硝酸盐的亲和力较高。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41564-023-01578-6

五、辰英价值

该文章在从水稻土壤中提取分离反消化菌的过程中，采用了自主研发的PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪。

该仪器应用激光诱导向前转移（LIFT）技术，实现了尺寸微小、形态多样化的微生物单细胞的可视化精准筛选；其采用芯片式（非管道）的上样方式，特别适用于土壤等杂质较多、成分复杂的微生物样品，不会存在传统流式等方法中样品堵塞管道等问题。

另外，本技术的非接触分选特点，使其对微生物细胞损伤极低，配合微阵列分选培养芯片能够实现单个细菌的分选后培养，高效获得目标菌株，助力微生物领域科研成果的产出。

六、研究团队介绍

姚翔午-浙江大学博士，现为浙江大学博士后

研究方向为甲烷和氮素的厌氧生物转化，发表SCI论文13篇，其中以第一作者身份在《Nature Microbiology》等国际知名期刊发表论文2篇，申请国家发明专利和实用新型专利各1项。

胡宝兰-浙江大学求是特聘教授

浙江省“万人计划”科技领军人才，浙江省“151人才工程”二层次。浙江省微生物生态专委会主任委员，浙江省纳米毒理专委会副主任委员，中国沼气学会理事，中国环境微生物学会专委会委员。受聘浙江省“五水共治”专家，浙江省农业生态与能源技术创新的与推广服务专家。

主要从事环境微生物学和环境生物技术方面的研究工作。主持国家自然科学基金、国家重点研发课题、国家科技支撑计划、浙江省重点研发课题等纵向课题20多项，承担企业委托课题20余项。国内外期刊上发表论文100多篇，其中SCI论文134篇，ESI高引论文5篇，H=43，总他引次数5000多次。参编著作/教材8本，授权国家专利50多项，其中发明专利27项。

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