染色多孔板，怎么拍才好看？| Amersham 小课堂-医疗器械网

染色多孔板，怎么拍才好看？| Amersham 小课堂

来源：Cytiva（思拓凡）分类：行业标准 2024-01-30 09:45:06 5阅读次数

师姐

师弟，怎么愁眉苦脸的？??

师弟

师姐，老师说我用手机拍的多孔板结果不够清楚，图片不清楚，计数就更困难了，我这正发愁到哪去借个单反相机呢？??

师姐

这还用得着单反，咱们实验室拍WB和蛋白胶的成像仪 Amersham ImageQuant 800就能拍结晶紫染色多孔板。

师弟

尊嘟假嘟，师姐你可别骗我！??

师姐

骗你做什么，带上你的孔板样品，咱们试一试就知道了。

师姐

师弟，你的实验结果好怪，平时我们的细胞结晶紫染色都是白底紫点，为什么你的多孔板整个孔都是紫色的呀？

师弟

还有师姐你不知道的实验，这是用来评估病毒感染性和增殖能力噬斑实验。??

师姐

那你快给师姐讲讲这个实验怎么做？师姐教你怎么拍出漂亮的孔板!

病毒噬斑实验 (Plaque assay) 指的是用待测病毒感染宿主细胞后，在固体介质的限制下，从最初感染的细胞中释放的病毒只能向宿主细胞周边扩展，经过一段时间的增殖，感染病变细胞聚集的区域会形成空斑，即病毒噬斑。不同的生长条件，不同种类的病毒，其噬斑形态也有显著差异。因此噬斑大小、分布，边缘情况都可以提供有关病毒生长和毒力因素的有价值的信息。

其基本步骤为：

培养宿主细胞：在多孔板中培养宿主细胞，达到汇合度90%以上；

配制固体介质/固体覆盖层：固体介质的配方多种多样，常见配方包括，0.6%琼脂糖，2%羧甲基纤维素 (CMC) 或2.4%胶体微晶纤维素 (avicel) 的水溶液，固体介质使用前需高压灭菌；

病毒感染：将不同稀释倍数的病毒感染液与宿主细胞进行共培养，一段时间后弃去病毒感染液，加入固体介质继续培养；

固定，染色：先向孔板中加入10%甲醛溶液，固定后弃去甲醛溶液，再加入0.5%结晶紫染液染色，待染液充分渗透后，用清水洗去浮色；

拍照并分析：用成像设备对多孔板进行成像，对每孔的噬斑数进行计算，对相同稀释倍数的复孔取平均值以计算病毒滴度，计算公式为：噬斑形成单位 (PFU/mL) =平均噬斑数/（病毒感染液稀释倍数×病毒感染液体积 (mL) ）。

师姐

新的知识增加了，下面让我来教你怎么拍出好看的孔板图片吧!

首先，从机器里拿出我们平时拍WB的黑色样品盘和白色垫板，拍多孔板要用的是底部透明的这款透明样品盘。将多孔板放置在样品盘中间，将透明样品盘推入IQ800的下层样品仓，选择Colorimetric模式中的OD measurement，点击start进行拍摄就好啦。

图1：从左到右依次为透明样品盘、NP透镜、NP透镜导轨

师弟

这个结果果然比我用手机拍的好看多了！谢谢师姐。??

师姐

想不想让图片更好一点？师姐还有秘密武器，铛铛铛！NP透镜，使用时，先把透镜导轨放在透明样品盘里，把多孔板放在导轨中心方形开口的位置，再把样品盘推入样品仓下层，最后将NP透镜放入下层样品托盘上并推到底。之后的操作和前面一样，选择Colorimetric模式中的OD measurement进行成像。

师弟

哇，用了透镜就是不一样，样品孔边缘被遮住的部分消失了，这样数起噬斑就更准确了！

师姐

你不会还在手动计数吧？是时候解放自己了，看我怎么用分析软件ImageQuant TL自动计数我的实验结果吧！

首先，在首页点击Colony Counter功能，在Image步骤中点击Open打开需要计数的图片。之后，在Detect步骤中拖动鼠标左键框选需要计数的区域，一个样品孔就是一个计数区，滑动滑块调整灵敏度，斑点直径等选项，点击Detect，获得计数结果。如果觉得斑点识别不准，可以在Edit步骤中，使用Draw和Delete，手动添加或删减图中计数的斑点，连接在一起的斑点用Split功能划线进行分割。