利用HEK293T细胞开发慢病毒载体生产工艺-医疗器械网

利用HEK293T细胞开发慢病毒载体生产工艺

来源：Cytiva（思拓凡）分类：科技文献 2024-05-06 10:00:09 14阅读次数

慢病毒 (LV) 是一种RNA病毒，其特点是能够将病毒RNA整合到宿主细胞DNA中。因此，慢病毒载体 (LVV) 被用于细胞和基因治疗领域，在体外和体内将核酸递送到靶细胞中。我们开发了一种可放大的上游工艺，在Xcellerex XDR 10一次性生物反应器和ReadyToProcess WAVE 25波浪式生物反应器中，使用悬浮培养的HEK293T细胞进行LVV生产。

本文叙述了HEK293T悬浮细胞从复苏到摇瓶培养，再扩增到生物反应器培养的工艺过程。整个培养及转染工艺过程使用的是HyClone的peak expression medium (PEM) 无血清培养基，最终在生物反应器中瞬时转染并获得了高滴度的LVV。

在此，我们利用实验设计 (DoE) 方法来优化HEK293T悬浮细胞系统的LVV生产，并分阶段进行实验：

首先，利用DoE方法在摇瓶培养规模，通过评估和优化多个对LVV产量增加起关键作用的因素，如质粒浓度、活细胞密度和收获时间等，建立转染方案。

接下来，使用第一步建立的转染方案在 Xcellerex XDR 10或ReadyToProcess WAVE 25中进行LVV生产。

在Xcellerex XDR 10和ReadyToProcess WAVE 25生物反应器系统上，我们进行了三次重复的LVV生产，验证了高效和稳健的可放大细胞培养工艺。具体流程见下图（图1）：

图1

图1所示，LVV生产过程的概述。我们将在本文中讨论细胞培养和转染工艺的建立过程。

本文所述工艺采用的是四质粒转染系统 (Cell Biolabs) ，包括两个包装载体，一个包膜载体和一个携带绿色荧光蛋白 (GFP) 报告基因的表达载体，及PEI MAX (Polysciences) 转染试剂。聚乙烯亚胺 (PEI) 与质粒DNA产生带正电的复合物，质粒DNA通过内吞作用进入细胞并将DNA传递到细胞核，使外源DNA的基因在293细胞体内表达（图2）。

图2

图2所示，使用四质粒转染方法瞬时转染HEK293T细胞。PEI与DNA形成复合物，然后将其引入宿主细胞。

实验流程及结果

HEK293T细胞悬浮驯化并适应到无血清培养环境

我们将在HyClone DMEM培养基和10%胎牛血清 (FBS) 中贴壁生长的HEK293T细胞，消化后直接转移到HyClone PEM培养基中进行传代培养，经10次传代后，通过观察悬浮细胞的生长和形态，确定细胞已完全适应无血清悬浮培养。

PEM培养基是即用型的无血清293培养基，含有稳定型L-谷氨酰胺和泊洛沙姆188。

利用HEK293T悬浮细胞优化LVV生产方案

DoE研究采用全因子设计，包括5个参数（活细胞密度、孵育时间、增强剂浓度、增强剂添加时间和DNA浓度），以评估转染的最佳条件。在我们的DoE开发过程中，设定的标准是达到10¹⁰个病毒颗粒 (VP/mL) 和10⁷个转导单位 (TU/mL) 。

实验结果发现，每一个条件的优化都可以使病毒滴度超过DoE设定的标准。

为了摸索转染最适合的活细胞密度 (VCD) ，我们没有进行额外的DoE，而是进行了一个简单的实验。其中只测试了三个不同的VCD和孵育时间，并根据DoE的结果设置了所有其他参数。实验结果表明，活细胞密度为3×10⁶个/mL，孵育时间为5 min，可以获得最大滴度（图3）。

图3

图3所示，评估VCD和孵育时间。所有测试VCD的DNA-PEI复合物孵育时间为10分钟。所有测试孵育时间的VCD为2×10⁶个/mL。

优化转染方案

在进行了初始DoE研究后，根据结果设计了LVV生产方案（表1）。

表1：用于转染方案的最终参数

细胞系	HEK293T，经过悬浮驯化
培养基	HyClone peak expression medium
转染试剂	PEI MAX 40k
质粒比例	1:1:1:3 (1 pRSV-Rev: 1 pCMV-VSV-G: 1 pCgpV: 3 pGFP)
转染时细胞密度（活细胞数/mL）	3×10⁶
DNA (μg/mL)	1
DNA:PEI 比例 (μg:μL)	1:2
转染试剂孵育时间 (min)	5
丁酸钠添加（转染后的小时数）	5
丁酸钠终浓度 (mM)	10
收获时间（转染后的小时数）	72

为了确认LVV生产的转染方案，使用HyClone PEM培养基在摇瓶中进行三次1 L的 LVV生产。病毒液的滴度在所有重复中都高于接受标准，并且重复之间的方差很小（图4）。

图4

图4所示，用1 L HyClone PEM培养基在摇瓶中生产LVV的病毒滴度。

在Xcellerex XDR 10一次性生物反应器生产LVV

首先，将HEK293T细胞在摇瓶中扩增，产生足够的细胞用于接种到Xcellerex XDR 10。在反应器中初始培养基体积为5 L，接种细胞密度为0.4×10⁶个/mL。接着扩增细胞72 h到细胞密度约为3×10⁶个/mL。随后加入HyClone PEM培养基稀释培养体积至约9.2 L。

接种96 h后按优化方案进行转染。将转染复合物加入反应器中，最终反应器体积为10 L，细胞浓度为3×10⁶个/mL。转染5小时后，加入终浓度为10 mM的丁酸钠。转染72小时后收获。Xcellerex XDR 10中三个批次的结果如图5所示。所有三次生产结果的病毒滴度均高于接受标准。

图5

图5所示，在Xcellerex XDR 10中三次生产LVV的细胞生长和活率。接种96 h后转染，转染72 h后收获。

为了确认Xcellerex XDR 10的转染效率，除了流式细胞术分析外，我们还对细胞在显微镜下进行了明场和荧光的评估。图6为收获时LVV稀释样品中GFP阳性荧光细胞。

图6

图6所示。(A) Xcellerex XDR 10收获LVV时的明场和 (B) 荧光显微镜图像。

所有三个生产批次的病毒滴度相似，约为10¹⁰ VP/mL和10⁷ TU/mL（图7）。所有三个批次之间的一致性表明工艺设计是稳健的，适用于生产目的。

图7

图7所示，使用Xcellerex XDR 10三次生产LVV的病毒滴度。实验的接受标准用红色虚线突出显示。所有生产批次均符合标准。

在ReadyToProcess WAVE 25波浪式生物反应器生产

最后，我们使用ReadyToProcess WAVE 25生产5 L LVV。在摇瓶中扩增HEK293T细胞，然后在ReadyToProcess WAVE 25中接种HEK293T悬浮细胞，起始培养基体积2.5 L，接种密度0.3×10⁶个/mL。培养72 h至细胞密度达到约3×10⁶个/mL。随后加入HyClone PEM培养基稀释体积至约4.8 L。在接种96 h后按优化方案进行转染。将转染复合物加入反应器中，最终反应器中工作体积为5 L，此时细胞密度为3×10⁶个/mL。转染后5小时，加入终浓度为10 mM的丁酸钠。转染后72小时进行收获。ReadyToProcess WAVE 25中三个生产批次的结果如图8所示。