KTA蛋白层析系统延迟体积的确定与设置-医疗器械网

KTA蛋白层析系统延迟体积的确定与设置

来源：Cytiva（思拓凡）分类：操作使用 2024-03-21 10:34:30 9阅读次数

智荟专线

400-810-9118，2号键

#智荟锦囊

?KTA蛋白层析系统的流路自身包含一定管路体积，这部分管路体积又称为延迟体积。延迟体积依据位置不同可以分为梯度延迟体积和收集延迟体积，本文将对以上两种延迟体积定义、延迟体积确定方法和UNICORN系统中延迟体积的设置进行详细介绍。

梯度延迟体积（Gradient delay volume）

梯度延迟体积是指设置梯度程序时混合池与层析柱入口之间的体积，这部分管路体积会导致层析柱中真实梯度与程序中的梯度 (%B curve) 出现一定的延迟（图1）。梯度延迟体积可以通过理论计算和实验测定的方法获得，在使用特定混合器的层析系统中梯度延迟体积是一个定值，不会随着使用层析柱体积大小发生改变。对于离子交换等通过拉梯度方式进行洗脱的层析方法，进行梯度优化时尤其要注意，样品洗脱峰对应B%浓度，是此时混合池正在混合的梯度，并非样品被洗脱当时进入柱子的B%盐浓度。此时，可以用开始给混合池梯度命令（绿色线起点）和电导检测器检测到电导值开始增加（蓝色线起点）之间的体积差，近似作为梯度延迟体积，用于倒推样品洗脱时对应的B%浓度。

图1. 真实梯度（蓝色）对比程序梯度（绿色）

收集延迟体积（Fraction delay volume）

?KTA系统收集延迟体积指UV检测器到样品收集器或者UV检测器与outlet之间管路的体积（图2）。

图2. 蛋白层析系统?KTA系统延迟示意图

?KTA蛋白层析系统收集样品时，需要在系统中准确设置收集延迟体积，从而避免因为收集延迟体积错误，造成?KTA紫外峰图显示的样品出峰位置与对应的收集管发生错位的现象（图3）。图3中（a）图没有收集设置延迟体积导致SDS-PAGE胶图与UV峰图相比出现滞后现象；而（b）图中准确设置收集延迟体积，SDS-PAGE胶图与UV峰图可以较好的进行对应^[1]。

图3. 系统延迟体积设置对收集位置的影响^[1]

收集延迟体积确定方法

系统延迟体积可以通过理论计算和实验测定的方法进行确定，以下将对两种延迟体积确定方法分别进行介绍。

收集延迟体积理论计算方法

理论计算是获得延迟体积较简便方便的方法，延迟体积理论计算包括以下3个步骤：

确定设备系统流路中所有成分部件。

查表确定系统流路中各个硬件单元（?KTA pure User Manual 9.14章节）和单位长度管路对应体积（表1）。

计算系统延迟体积：将混合池体积与连接层析柱管路体积相加即获得梯度延迟体积；将UV检测器样品流通池的1/2体积（UV检测器检测点为流通池中心区域）与流路中其它硬件与管路的体积进行加和，得到收集延迟体积。

注：pH阀V9-pH和V9H-pH对应体积一般以阀门在bypass位置的体积计算，如果pH阀inline系统会自动计入限流器和pH流通池的体积。

表1. ?KTA系统不同内径管路应用及单位长度管路内部体积

收集延迟体积的实验测定方法

UV吸收值测定法

连接F9-R和F9-T收集器的?KTA pure系统（图3）可以通过UV吸收值测定的方法得到，通过测定V1（样品入口与UV检测器之间体积）、V2（样品入口到收集器样品出口端之间的体积），计算V2-V1+1/2V（V为UV检测器流通池体积）获得延迟体积^[2][3]。具体实验步骤如下：

设置系统流速1 ml/min（如果流速不准确，检查系统泵是否进气，继续实验前确定流速的准确性）。

使用1%-5%丙酮溶液充满样品环（例：样品体积100 μl）。

设置UV检测器到收集器之间所有部件为bypass模式。

用水充满系统管路，设置流速1 ml/min，用样品环中丙酮溶液为样品上样。

计算从样品注入点开始到层析图谱紫外吸收最高点流路体积，即为V1。

重新配置系统流路，将收集器置于UV检测器之前。断开UV检测器两端管路，用死体积较小的连接头将两端管路连接起来。收集器出口管路连入UV检测器，UV检测器出口端接入废液口Waste。

设置一个较大的收集体积（比如100 ml），保证实验过程中样品从收集口流出。

设置流速1 ml/min，加入样品丙酮溶液。

计算从样品注入点开始到层析图谱紫外吸收最高点流路体积，即为V2。

依据公式计算V2-V1+1/2V（V为UV检测器流通池体积），获得延迟体积。

注：该方法不适用?KTA avant蛋白层析系统，因为用户无法拆掉其样品收集器连接的管路。

图4. （A） ?KTA pure蛋白层析系统（B）F9-R收集器（C）F9-T收集器

称重法

通过称量水的重量测定收集延迟体积（容器重量需要预先称重）^[3]。

设置系统流路从UV流通池直接流向收集器。

用鲁尔接头替换UV检测器入口接管。

用注射器将UV流通池到收集器尖端整个管路用水充满。

使用注射器用空气将UV流通池到收集器尖端整个管路中的水完全替换出来。

通过称量水的重量测定收集延迟体积。

重复3次实验取平均值。

标准配置的?KTA pure收集延迟体积

标准配置、使用标准长度管路的?KTA pure设备，其设备标准延迟体积数据已在?KTA pure使用手册中列出。手册中延迟体积数据是依据U9-M紫外检测器计算，如果使用U9-L紫外检测器需要在此体积基础上加9μl （2mm流通池）、4μl（5mm流通池）。

标准配置?KTA pure Micro/Micro kit配置微量紫外检测器、微量电导检测器和微量出口阀。

标准配置的?KTA pure系统可以通过查询对应表格（表2、表3和表4）得到标准配置设备收集延迟体积信息。

其他型号标准配置的?KTA蛋白层析系统也可以通过查询使用手册获得设备标准收集延迟体积。

表2. ?KTA pure25收集延迟体积

表3. ?KTA pure Micro/Micro kit收集延迟体积

表4. ?KTA pure 150收集延迟体积

UNICORN系统中收集延迟体积的设置

UNICORN系统中可以设置UV检测器到Outlet阀及UV检测器到收集器之间的延迟体积（图4），具体设置步骤如下：

在System Control界面选择System-Settings，打开System Settings对话框。

点击 Fraction collection →Delay volumes。

在Detector-Frac 中输入UV检测器到收集器之间的延迟体积数值；在 Detector – Outlet中输入UV检测器到出口阀之间的延迟体积数值。

注：系统使用对应配置的延迟体积时会自动忽视其他设置的体积（比如使用收集器收集时，UV检测器到Outlet阀的延迟体积数值将被忽视）。因此建议设置各部分延迟体积，以便在更改收集方式时保证延迟体积的正确性。

图4. UNICORN系统延迟体积的设置界面

需要说明的是不同型号的?KTA蛋白层析系统延迟体积的确定和设置方法，操作细节上可能存在细微差别，具体设置方法可以查看对应型号产品的使用手册。

参考文献：

1. 芦亚菲. 《蛋白质制备与鉴定平台蛋白层析系统介绍》清华大学蛋白质研究技术中心蛋白质制备与鉴定平台 2020/05/16 https://phoenix.tsinghua.edu.cn/index.php?c=show&id=519

2. ?KTA pure User Manual 29119969 AE

3. ?KTA Laboratory-scale Chromatography Systems CY13989-02Dec20-HB. Appendix 3 Determination of delay volumes

声明：本文为作者原创首发，严禁私自转发或抄袭，如需转载请联系并注明转载来源，否则将追究法律责任

点击“阅读原文”即刻前往官网了解更多资讯

点亮

与

，传递信息 ↓ ↓

标签：

参与评论

登录后参与评论

全部评论(0条)

联系我们

关注我们