光谱应用 | 利用紫外线吸收度量化蛋白质浓度-医疗器械网

光谱应用 | 利用紫外线吸收度量化蛋白质浓度

来源：北京爱蛙科技有限公司分类：技术参数 2023-11-24 10:15:53 0阅读次数

蛋白质是临床、诊断和研究实验室的常见样本，涉及蛋白质提取、纯化或标记的研究，或使用从细胞中提取或标记的蛋白质来研究生物分子之间的相互作用。蛋白质浓度的测定是蛋白质研究的关键部分。在本应用中，我们使用Ocean HDX光谱仪生成牛血清白蛋白（BSA）的标准曲线。高灵敏度的紫外线、超低应力的光性能和升级的光学系统使Ocean HDX光谱仪成为紫外线吸光度测量的理想之选。

蛋白质是生命的核心。这些错综复杂的生物大分子在细胞过程和新陈代谢、催化生化反应、充当结构元素等方面都发挥着至关重要的作用。作为所有生命的重要元素，蛋白质通常是生物医学诊断研究和生命科学研究的主题。大多数涉及蛋白质的研究，无论正在寻找的答案是什么，也无论蛋白质的来源是哪里，都会从以下几个方面开始，首先要量化样品中蛋白质含量。

一、量化蛋白质浓度

量化蛋白质浓度的方法有两种：利用紫外线吸光度进行直接检测或使用比色法进行可见光吸光度检测。直接在280nm波长处测量吸光度，芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的吸光相对较快，而且测量过程中不会消耗蛋白质。使用试剂的比色测定可提供总蛋白质浓度，但蛋白质杂质会影响结果。

无论使用哪种方法进行蛋白质定量，第一步都是测量相关蛋白质或标准蛋白质的若干稀释液的吸光度。就直接紫外吸光度法而言，280nm处的吸光度与每个样品的已知浓度的关系，根据比尔定律（也称为比尔-郎伯定律），溶液的吸光度取决于吸收分子的浓度和光穿过样品的路径长度。根据这一关系，我们可以利用已知蛋白质样品生成的标准曲线来确定未知蛋白质样品的浓度。

比尔定律：A（λ）= ε（λ）cl，

A（λ）为溶液的吸收度，是波长的函数
ε（λ）是吸收分子的摩尔吸收系数或消光系数，是波长的函数（L/mol·cm）
c为溶液浓度（mol/L）
l是光穿过溶液的路径长度（cm）

通过数据点的最佳拟合线来确定未知蛋白质浓度。请注意，标准曲线的线性部分是用于确定未知样品浓度的唯一区域。测量值超出标准曲线线性范围的样品必须稀释，直到吸光度在线性范围内。根据超出测量浓度范围或超出曲线线性区域的数据来进行浓度预测是无效的。

我们使用Ocean HDX光谱仪用于紫外吸光度测量，生成了牛血清白蛋白（BSA）的标准曲线。Ocean HDX的高清光学系统使其成为紫外线吸光度测量的理想选择，超低杂散光可实现更高的最大吸光度水平，升级的光学器件体积小巧，性能卓越。

二、实验步骤

用水配置6mg/mL的BSA（Sigma P/N A2153）储备液，并稀释至0.02mg/mL，绘制标准曲线，用于预测未知蛋白质样品的浓度。BSA通常用于生成标准蛋白质校准曲线以预测蛋白质浓度。

使用OCEANHDX-UV-VIS光谱仪、DH-2000-BAL平衡氘钨卤素光源、CUV-UV比色皿支架、两根QP230-2-XSR 极耐晒光纤和OceanView 软件中的Absorbance Wizard 测量吸光率。由于BSA不吸收可见光区域的光，因此只使用氘灯进行测量。将光源限制在发生吸收的区域，可减少测量中的杂散光，从而提高高浓度样品的最大吸收水平。将光谱仪和光源预热60 分钟，以消除光谱仪和光源预热到一致温度时产生的漂移，从而提高测量的稳定性。

测量是在单个石英比色皿中进行的，测量过程中不要从比色皿架上取下比色皿。稀释是直接在比色皿中进行的，方法是取出0.5mL样品，然后换为0.5mL水。水加入比色皿后，使用一次性移液管混合样品。稀释可低至0.02 mg/mL。

三、结果

使用 Ocean HDX测量的蛋白质吸收光谱如图1所示。Ocean HDX的超低杂散光性能使我们能够测量280nm波长芳香族氨基酸峰近3 AU的吸光度。尽管此处未显示结果，但我们也在肽骨吸收的220nm波长附近测得了高于3 AU的吸光度值。

图1：BSA在水中稀释后的吸光度如比尔定律所预测

根据BSA吸光度数据生成的标准曲线如图2所示。在2.4和2.5 AU之间，观察到数据出现平缓或滚降。这种滚降现象表明测量中存在杂散光。杂散光（在不同程度上存在于所有吸光度测量中）限制了系统可以测量的最大吸光度值。

杂散光是指来自设计光路之外的光，无意中落到检测器的任何部分，从而产生错误读数。检测器并不区分落在检测器特定像素上的波长，它只是测量照射到检测器上的光的强度。因此，如果光线落在检测器某个像素（波长）上，而它不应该落在该像素（波长）上，检测器就会错误地输出该波长的读数。这种杂散光通常来自预定光源，但在光谱仪内发生散射，落在探测器的错误位置上，也可能来自完全不同的光源。杂散光为系统能达到的最大吸光度设定了一个工作极限，并通过限制系统的暗度来降低信噪比。杂散光的常见来源包括光栅的高阶反射、光栅的缺陷、光谱仪的内部反射以及光谱仪外壳的漏光。Ocean HDX 的杂散光最低，最大吸收水平最高。