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技术分享 | 当全息成像遇到Seahorse

来源：广州云星科学仪器有限公司分类：产品评测 2024-05-08 10:00:13 13阅读次数

活细胞的耗氧率（Oxygen Consumption Rate, OCR）是衡量细胞线粒体呼吸作用的一个重要指标，它反映了细胞对氧气的消耗速率。OCR的检测对于理解细胞的能量代谢、线粒体功能以及细胞健康状况具有重要意义；安捷伦Seahorse XF分析仪是实时监测活细胞生物能量代谢的金标准，它使用无标记传感器技术，可以在细胞培养过程中实时监测OCR和ECAR，从而评估线粒体呼吸和糖酵解活性。这种技术特别适用于需要实时、动态监测细胞代谢状态的研究，如药物筛选、细胞功能研究和疾病模型分析。而随着研究的不断深入，通过多参数、多维度的检测方式，特别是将活细胞的耗氧率结合成像技术，形成更有效的检测方式，不仅可以提供细胞代谢活动的定量数据，还可以通过成像技术直观地观察和记录细胞的形态、位置和动态变化。

其中采用Nanolive活细胞成像系统和Seahorse XF分析仪联用是一种比较成熟的检测方式，Nanolive活细胞成像系统采用先进的3D无标记成像技术，允许许科研人员在无需对细胞进行染色或标记的情况下对活细胞进行详细的三维结构观察和分析。通过全息成像技术，可以在不需要荧光标记的情况下，观察和分析细胞的三维结构，该系统能够实现高达200nm的横向分辨率和400nm的纵向分辨率，从而捕捉到细胞内部结构的细节，如线粒体、脂质体、细胞核等, 成像过程对细胞无损伤，允许进行长时间的活细胞观察，而不会对细胞造成光毒性或漂白。

以下是OCR检测和全息成像联用的文章,《Mitoquinone shifts energy metabolism to reduce ROS-induced oxeiptosis in female granulosa cells and mouse oocytes 》这篇是关于线粒体靶向抗氧化剂MitoQ对雌性生殖细胞和卵母细胞在氧化应激下的影响的研究，发表在《Aging》杂志。研究MitoQ是否能够抵抗活性氧（ROS）诱导的人类颗粒细胞和鼠卵母细胞的凋亡。活性氧 (ROS) 是细胞代谢的副产品，在卵泡和胚胎发育中发挥重要作用。卵泡液中的ROS主要由卵巢颗粒细胞、巨噬细胞和卵泡膜细胞产生，而卵母细胞代谢受损会产生过量的自由基。因此，卵泡液中ROS水平可以反映卵泡的代谢状态。

研究者首先验证MitoQ是否可以保护细胞免受 ROS 引起的细胞死亡，通过MitoQ 处理24h后进行流式细胞仪(图1A)以及Annexin V-FITC/PI（碘化丙啶）双重染色区分凋亡细胞和坏死细胞(图1B)，随后Western blotting验证凋亡标志物的差异表达(图1C)，证明了氧化分解级联的激活是颗粒细胞中 ROS 诱导的细胞死亡的机制之一，进一步通过Nanoilive全息延时成像,观察在不同处理中的细胞动态变化(见下方视频)，在ROS组中，第54分钟，颗粒细胞周围开始出现微泡。当暴露于ROS较长时间时，这些微泡变得更大，伴随着细胞伪足的逐渐消失，最终细胞出现为巨大的囊泡。相比之下，用 MitoQ 预处理后暴露于 ROS 的细胞保持运动并进行有丝分裂。最终，细胞并没有失去伪足并且看起来很健康,因此可以得出这样的结论MitoQ 保护细胞免受 ROS 诱导的氧化凋亡。

图1: MitoQ 对 ROS 诱导的氧化应激的影响。(A) 在处理 24 小时的 MitoQ 上进行流式细胞术，然后用 0.8 mM H2O2 处理 4 小时，并用膜联蛋白 V/PI 双染色。(B) 分别对每个象限中膜联蛋白 V/PI 双染细胞群进行定量。

随后Seahorse生物能量分析仪分析耗氧量, OCR 曲线表明，与 ROS 组相比，MitoQ 处理显着增强了 OCR 曲线。MitoQ 处理的细胞从 ROS 诱导的低耗氧量中恢复，包括基础呼吸（图 4B）、最大呼吸（图 4C）和 ATP 产生（图 4D）值得注意的是，MitoQ单独使用以及与ROS组联合显着增加了ROS组的细胞内储备能力（图4E）。此外，ROS 组的非线粒体呼吸显着低于其他三组（图 4F）。相比之下，四组之间的质子泄漏没有显着差异（图4G）。这些发现表明 MitoQ 可以调节细胞线粒体并提高线粒体周转率以增加细胞内能量。

图2: MitoQ 提高人类颗粒细胞的线粒体耗氧量。(A) 通过 Seahorse Bioscience 分析仪通过耗氧率 (OCR) 分析细胞线粒体功能。分析基础呼吸（B）、最大呼吸（C）、ATP产生（D）、保留呼吸（E）、质子泄漏（F）和非线粒体呼吸（G）不同阶段的所有OCR值，并进行对照、MitoQ、ROS 和 ROS/MitoQ 组进行了分析。寡霉素 (1 μM)、FCCP (1 μM)、抗霉素 (0.5 μM) 和鱼藤酮 (0.5 μM)。与对照相比，*p < 0.05、**p < 0.01 和 ***p < 0.001。与仅 ROS 相比，#p < 0.05、##p < 0.01 和 ###p < 0.001。

综上所述, Nanolive活细胞成像系统和Seahorse XF分析仪的联用可以为细胞生物学研究提供一种强大的工具组合，Nanolive系统提供无标记、非侵入式的3D活细胞成像，可以实时观察细胞的形态和动态变化，包括细胞骨架、细胞周期、细胞自噬等，结合Seahorse XF分析仪可以实时监测细胞的耗氧率（OCR）和胞外酸化率（ECAR），从而评估线粒体功能和细胞代谢状态，这种不同角度的参数检测,在药物作用机制研究中，结合细胞形态结构和细胞代谢的变化，更加全面了解药物的作用机制，在肿瘤学、神经科学、再生医学等领域为不同状态下的细胞代谢和形态变化提供更为全面的信息。

原论文链接可点击“ 阅读原文 ”查看。

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