本文要点：近红外二区 (NIR-II) 染料可以被外源性或内源性白蛋白包裹，形成用于深部组织生物成像的稳定复合物。本文确定了控制花菁染料与白蛋白超分子/共价结合的几个关键参数：含Cl的六元环、小尺寸侧链和相对较高的疏水性。设计的荧光团(IR-780@albumin) 具有显著增强的光稳定性，可作为 NIR-II生物成像的长效成像探针。本文研究表明，含氯花菁染料（例如 IR-780）可以更有效地嵌入白蛋白中，从而产生更稳定的荧光探针。这一发现部分解决了临床上可用的花菁染料的光漂白问题，丰富了 NIR-II生物成像和手术导航的探针库。

先前研究已经证明了含氯花菁染料和白蛋白之间通过共价键结合。然而，目前仍然缺乏对结合机制的详细研究来指导稳定探针的形成。

作者首先筛选了一个与白蛋白结合的花菁染料库，并在测试了亮度增强xiao应。如Figure 1B所示，通过比较在DMSO、PBS和BSA中的9种染料的亮度，发现花菁染料@BSA与在DMSO中相比可以恢复部分亮度，而在PBS中由于ACQ效应而聚集淬灭。IR-783@BSA、IR-808@BSA和 IR-780@BSA与其他染料相比具有更高的荧光增强（Figure 1C）。接着优化了染料和 BSA 的摩尔比，1：1结合有最佳的亮度增强xiao果（Figure 1D）。IR-780@BSA 光稳定性显著提高，在 NIR-II窗口下半衰期超过25 min （Figure 1E）。IR-780@BSA 的红移和荧光增强可能是受限扭曲分子内电荷转移(TICT)的影响（Figure 1F&G）。

高浓度的花菁染料@BSA对激光的耐受性更高（Figure 2A&B），其中IR-780@BSA在所有反应浓度下都比IR-783@BSA更稳定。作者进一步选择了三种组合：花菁:BSA = 1:1（100μM）；花菁:BSA = 2:1（100μM）；花菁:BSA = 1:1（200μM），比较了亮度衰减的时间点（t）和亮度（B），结论是光稳定性主要由花菁@BSA的浓度决定，过量的花菁会淬灭花菁@BSA的亮度并延长亮度衰减的时间点。

接下来探索了花菁@BSA体系的光稳定性，在模拟血液环境下，体系浓度为10 ~ 400μM（Figure 2C，Group 1,2）。当花菁与蛋白质比例小于1时，PBS和BSA中的光稳定性趋势相似，表明当花菁与BSA完全结合时，花菁@BSA荧光团不受缓冲液环境的影响（Figure 2C，中间）。摩尔比>1的花菁@BSA体系中，游离花菁可以淬灭荧光团亮度，而纯花菁@BSA可以保持初始亮度（Figure 2C，右）。因此，BSA缓冲液可以通过与游离花菁结合而提高花菁@BSA体系（摩尔比 >1）的亮度。

稀释后（Group 1）和10μM 花菁@BSA体系（Group 3）之间的相似趋势证明，浓度可以影响光稳定性但不改变结合性质。对于摩尔比>1的花菁@BSA体系，BSA缓冲液稀释（Group 2）比PBS（Group 1）以及10μM反应体系（Group 3）中更具光稳定性。此外，IR-780在不同浓度BSA中的吸收和发射光谱表明，亮度主要由IR-780和BSA之间的相互作用主导。虽然峰值发射（800−850 nm）随着BSA的增加而增加，但当BSA:IR-780 > 1时，超过850 nm的尾部发射强度是等效的（Figure 2D）。作者还比较了高浓度 (400μM)花菁@BSA被PBS稀释前后的亮度（Figure 2E）。

进一步研究了IR-780/IR-783与BSA结构域 I (DI)、结构域 II (DII) 和结构域 III (DIII) 之间的结合能力。Figure 3A&C所示，花菁@DIII比花菁@DI和花菁@DII亮得多。从电泳结果 (Figure 3B, D) 来看, DI和DIII都可以有效地与花菁染料形成共价键。室温下在较短的反应时间里，含氯化物的花菁染料也可以与 DIII 共价结合，而与DI共价结合需要更长的反应时间。然而，共价结合并没有提高染料@DI的亮度。从光谱数据（Figure 1F、G ）来看，DI和DIII表现出与BSA相同的促进吸收峰红移的效果，但只有DIII同时增强了吸收和发射强度。

为了准确理解花菁与白蛋白或白蛋白片段之间的作用机制，作者利用商业化花菁染料（ICG, IRdye800CW, IR-775, IR-780, IR-783, IR-797, IR-806, IR-808, and IR-820）系统分析。比较九组花菁@蛋白的亮度数据（Figure 4A），亮度的增强并不依赖共价结合。Figure 4C表明DIII是主要的结合位点，DI使第二结合位点。花菁与蛋白之间有效的超分子作用的对于稳定TICT至关重要，因此增量了NIR-II亮度。Figure 4B电泳分析结果表明，含氯环己烯基团的花菁（IR-775, IR-780, IR-783, IR-808）和BSA，HAS，DIII有完整的相互作用，而IR-820是个特例。因此，作者合理推测萘的空间位阻阻挡了IR-820与血清蛋白之间的接触，从而降低了有限时间内共价结合程度。IR-820与DIII的相互作用程度较高证实了这一假设。

此外，电泳结果发现不含Cl的染料（IRdye800CW，ICG）没有观察到与蛋白的结合。基于这一点，作者假设位阻和亲水性阻止了有效的超分子作用。ICG与BSA、HAS结合后亮度增强，但与结构域结合没有明显变化。这进一步表明，整个白蛋白的疏水口袋对于锚定含氯和不含氯的染料都是必不可少的，而 DIII 需要共价结合才能有效地“钩住”含氯染料。然后比较了含Cl染料，包括五元环 (IR-797, IR-806) 和六元环 (IR-775, IR-783)。结果发现花菁染料与五元环 (IR-797, IR-806)仅形成部分共价结合。

作者进行了分子对接，并用长时间分子动力学模拟（MD）确认了染料与BSA之间理想的结合模式（Figure 5）。如Figure 5所示，IR-783@BSA与IR-808@BSA的结合位点相同，但是IR-780@BSA不同，它有一个更紧的口袋，这意味着更强的结合。三个探针的相对结合自由能分别是-47.56, -42.13, and -36.14 kcal/mol，这与实验观察一致。

作者分析了探针的基础代谢（Figure 6A-D）。静脉注射IR-780@BSA后，探针快速积累在肝脏，然后在全身分布，随后粪便排泄，与游离IR-780的肝胆代谢方式相同（Figure 6A&B）。然后评估了IR-780@DI和IR-780@DIII的体内行为。由于尺寸较小，这两种结构域衍生的探针都表现出肾脏排泄途径（Figure 6C、D）。尽管 IR-780@DI和IR-780@DIII给药小鼠的肾脏信号没有太大差异，但IR-780@DIII 的肾脏与皮肤比值在24~96 h内更为显著（Figure 6F）。随后追踪了不同花菁@BSA的体内行为，并证明探针的代谢行为与共价键合的程度有关。不含Cl 花菁@血清蛋白显示出快速的肝胆消除，与游离染料类似。含Cl 花菁@血清蛋白的代谢时间与光稳定性结果一致（Figure 6B）。体内代谢行为可以间接反映花菁@BSA的光稳定性特征。

最后进行淋巴结成像以评估NIR-II成像能力。使用三种花菁@BSA（IR-780@BSA，IR-808@BSA，IR-783@ BSA）和临床使用的ICG研究了淋巴结成像的光稳定性。IR-780@BSA在四个测试探针中仍然最稳定（Figure 6G）。IR-780@BSA（1 mM，25 μL）为腘窝淋巴结可视化提供了稳定的NIR-II成像，并且在长达60 min的连续激光照射中没有观察到信号衰减（Figure 6G）。在左脚掌注射IR-780@BSA以及右侧注射ICG，腘窝和骶骨淋巴结在俯卧位清晰地勾勒出来。成像时间测试长达6小时（淋巴结与皮肤比值≥3.6），满足了长时间成像导航手术（Figure 6H，I）。

参考文献

Bai, L.; Hu, Z.; Han, T.; Wang, Y.; Xu, J.; Jiang, G.; Feng, X.; Sun, B.; Liu, X.; Tian, R.; Sun, H.; Zhang, S.; Chen, X.; Zhu, S., Super-stable cyanine@albumin fluorophore for enhanced NIR-II bioimaging. Theranostics 2022, 12 (10), 4536-4547.

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