利用HEK293T细胞开发慢病毒载体生产工艺
慢病毒 (LV) 是一种RNA病毒,其特点是能够将病毒RNA整合到宿主细胞DNA中。因此,慢病毒载体 (LVV) 被用于细胞和基因治疗领域,在体外和体内将核酸递送到靶细胞中。我们开发了一种可放大的上游工艺,在Xcellerex XDR 10一次性生物反应器和ReadyToProcess WAVE 25波浪式生物反应器中,使用悬浮培养的HEK293T细胞进行LVV生产。
本文叙述了HEK293T悬浮细胞从复苏到摇瓶培养,再扩增到生物反应器培养的工艺过程。整个培养及转染工艺过程使用的是HyClone的peak expression medium (PEM) 无血清培养基,最终在生物反应器中瞬时转染并获得了高滴度的LVV。
在此,我们利用实验设计 (DoE) 方法来优化HEK293T悬浮细胞系统的LVV生产,并分阶段进行实验:
首先,利用DoE方法在摇瓶培养规模,通过评估和优化多个对LVV产量增加起关键作用的因素,如质粒浓度、活细胞密度和收获时间等,建立转染方案。
接下来,使用第一步建立的转染方案在 Xcellerex XDR 10或ReadyToProcess WAVE 25中进行LVV生产。
在Xcellerex XDR 10和ReadyToProcess WAVE 25生物反应器系统上,我们进行了三次重复的LVV生产,验证了高效和稳健的可放大细胞培养工艺。具体流程见下图(图1):
图1
图1所示,LVV生产过程的概述。我们将在本文中讨论细胞培养和转染工艺的建立过程。
本文所述工艺采用的是四质粒转染系统 (Cell Biolabs) ,包括两个包装载体,一个包膜载体和一个携带绿色荧光蛋白 (GFP) 报告基因的表达载体,及PEI MAX (Polysciences) 转染试剂。聚乙烯亚胺 (PEI) 与质粒DNA产生带正电的复合物,质粒DNA通过内吞作用进入细胞并将DNA传递到细胞核,使外源DNA的基因在293细胞体内表达(图2)。
图2
图2所示,使用四质粒转染方法瞬时转染HEK293T细胞。PEI与DNA形成复合物,然后将其引入宿主细胞。
HEK293T细胞悬浮驯化并适应到无血清培养环境
我们将在HyClone DMEM培养基和10%胎牛血清 (FBS) 中贴壁生长的HEK293T细胞,消化后直接转移到HyClone PEM培养基中进行传代培养,经10次传代后,通过观察悬浮细胞的生长和形态,确定细胞已完全适应无血清悬浮培养。
PEM培养基是即用型的无血清293培养基,含有稳定型L-谷氨酰胺和泊洛沙姆188。
利用HEK293T悬浮细胞优化LVV生产方案
DoE研究采用全因子设计,包括5个参数(活细胞密度、孵育时间、增强剂浓度、增强剂添加时间和DNA浓度),以评估转染的最佳条件。在我们的DoE开发过程中,设定的标准是达到1010个病毒颗粒 (VP/mL) 和107个转导单位 (TU/mL) 。
实验结果发现,每一个条件的优化都可以使病毒滴度超过DoE设定的标准。
为了摸索转染最适合的活细胞密度 (VCD) ,我们没有进行额外的DoE,而是进行了一个简单的实验。其中只测试了三个不同的VCD和孵育时间,并根据DoE的结果设置了所有其他参数。实验结果表明,活细胞密度为3×106个/mL,孵育时间为5 min,可以获得最大滴度(图3)。
图3
图3所示,评估VCD和孵育时间。所有测试VCD的DNA-PEI复合物孵育时间为10分钟。所有测试孵育时间的VCD为2×106个/mL。
优化转染方案
在进行了初始DoE研究后,根据结果设计了LVV生产方案(表1)。
表1:用于转染方案的最终参数
细胞系 | HEK293T,经过悬浮驯化 |
培养基 | HyClone peak expression medium |
转染试剂 | PEI MAX 40k |
质粒比例 | 1:1:1:3 (1 pRSV-Rev: 1 pCMV-VSV-G: 1 pCgpV: 3 pGFP) |
转染时细胞密度(活细胞数/mL) | 3×106 |
DNA (μg/mL) | 1 |
DNA:PEI 比例 (μg:μL) | 1:2 |
转染试剂孵育时间 (min) | 5 |
丁酸钠添加(转染后的小时数) | 5 |
丁酸钠终浓度 (mM) | 10 |
收获时间(转染后的小时数) | 72 |
为了确认LVV生产的转染方案,使用HyClone PEM培养基在摇瓶中进行三次1 L的 LVV生产。病毒液的滴度在所有重复中都高于接受标准,并且重复之间的方差很小(图4)。
图4
图4所示,用1 L HyClone PEM培养基在摇瓶中生产LVV的病毒滴度。
在Xcellerex XDR 10一次性生物反应器生产LVV
首先,将HEK293T细胞在摇瓶中扩增,产生足够的细胞用于接种到Xcellerex XDR 10。在反应器中初始培养基体积为5 L,接种细胞密度为0.4×106个/mL。接着扩增细胞72 h到细胞密度约为3×106个/mL。随后加入HyClone PEM培养基稀释培养体积至约9.2 L。
接种96 h后按优化方案进行转染。将转染复合物加入反应器中,最终反应器体积为10 L,细胞浓度为3×106个/mL。转染5小时后,加入终浓度为10 mM的丁酸钠。转染72小时后收获。Xcellerex XDR 10中三个批次的结果如图5所示。所有三次生产结果的病毒滴度均高于接受标准。
图5
图5所示,在Xcellerex XDR 10中三次生产LVV的细胞生长和活率。接种96 h后转染,转染72 h后收获。
为了确认Xcellerex XDR 10的转染效率,除了流式细胞术分析外,我们还对细胞在显微镜下进行了明场和荧光的评估。图6为收获时LVV稀释样品中GFP阳性荧光细胞。
图6
图6所示。(A) Xcellerex XDR 10收获LVV时的明场和 (B) 荧光显微镜图像。
所有三个生产批次的病毒滴度相似,约为1010 VP/mL和107 TU/mL(图7)。所有三个批次之间的一致性表明工艺设计是稳健的,适用于生产目的。
图7
图7所示,使用Xcellerex XDR 10三次生产LVV的病毒滴度。实验的接受标准用红色虚线突出显示。所有生产批次均符合标准。
在ReadyToProcess WAVE 25波浪式生物反应器生产
最后,我们使用ReadyToProcess WAVE 25生产5 L LVV。在摇瓶中扩增HEK293T细胞,然后在ReadyToProcess WAVE 25中接种HEK293T悬浮细胞,起始培养基体积2.5 L,接种密度0.3×106个/mL。培养72 h至细胞密度达到约3×106个/mL。随后加入HyClone PEM培养基稀释体积至约4.8 L。在接种96 h后按优化方案进行转染。将转染复合物加入反应器中,最终反应器中工作体积为5 L,此时细胞密度为3×106个/mL。转染后5小时,加入终浓度为10 mM的丁酸钠。转染后72小时进行收获。ReadyToProcess WAVE 25中三个生产批次的结果如图8所示。
图8
图8所示,在ReadyToProcess WAVE 25中三次生产LVV的细胞生长和活率。接种96 h后转染,转染72 h后收获。
为了确认ReadyToProcess WAVE 25的转染效率,除了流式细胞术分析外,我们还对细胞在显微镜下进行了明场和荧光评估。图9为收获时LVV稀释样品中GPF阳性荧光细胞。
图9
图9所示,(A) ReadyToProcess WAVE 25收获LVV时的明场和 (B) 荧光显微镜图像。
所有三个生产批次的病毒滴度相似,约为1010 VP/mL和107 TU/mL(图10)。
图10
图10所示,在ReadyToProcess WAVE 25中三次生产LVV的病毒滴度。实验的接受标准用红色虚线突出显示。所有生产批次均符合标准。
结论与讨论
我们建立了一种可放大且强大的LVV生产上游工艺,这套工艺使用培养于PEM培养基中的HEK293T悬浮细胞,首先在摇瓶进行转染条件的建立和优化,然后在ReadyToProcess WAVE 25和Xcellerex XDR 10进行了放大验证。实验结果表明:
每次生产都符合我们对收获病毒滴度设定的接受标准(≥1010 VP/mL和≥107 TU/mL)。
该方案还展现出从小摇瓶到10 L生物反应器规模的可扩展性。
感兴趣的老师,欢迎扫码我们将即时与您联系
点亮
与
,传递信息 ↓ ↓
全部评论(0条)
推荐阅读
-
- 利用HEK293T细胞开发慢病毒载体生产工艺
- 感兴趣的老师,欢迎文末扫码我们将即时与您联系
-
- 一种全新的病毒递送载体——指环病毒(Anellovirus)
- 一种全新的病毒递送载体——指环病毒(Anellovirus)
-
- 一次性使用病毒采样管可配灭活型/非灭活型VTM UTM病毒保存液
- 深圳市美迪科生物医疗科技有限公司一次性使用病毒采样管搭配VTM UTM病毒保存液,适用于多种病毒标本的保存和运输,具有广泛适用性、多种规格、优质材质、稳定配方等优点。
-
- 如何最大化 mAB 产量?灌流式细胞培养 + LAUDA 精准温控!
- 从 50L 到 5000L 的细胞培养工艺,LAUDA 都有相应的温度控制解决方案,既精准又稳定!
-
- Mshot明美大学巡展,活细胞成像仪与倒置显微镜亮相山东
- Mshot明美大学巡展,活细胞成像仪与倒置显微镜亮相山东
-
- 3D打印弹性生物超材料应用于细胞调控
- Nanoscribe双光子微纳打印系统实现了创建符合细胞大小和变形性标准的微结构生物超材料,以培养人类间充质干细胞。
-
- 赛恺泽,ASCO,前沿技术……一起回顾细胞治疗2024高光时刻~~
- 赛恺泽,ASCO,前沿技术……一起回顾细胞治疗2024高光时刻~~
-
- 探微观世界,赢科研好礼 ——SC-catcher单细胞显微光镊操纵与分选系统Demo实验征集活动正式启动!
- 长光辰英推出的SC-catcher单细胞显微光镊操纵与分选系统,集显微成像、光镊操纵与细胞分选于一体,为科研工作者带来前所未有的细胞操控体验。
-
- 寡核苷酸GMP产线的工程技术挑战及全工艺解决方案
- 寡核苷酸GMP产线的工程技术挑战及全工艺解决方案
-
- 实时无损原位获取“分子指纹”的利器丨单细胞检测级别的拉曼光谱检测分析平台
- 辰英生物拉曼检测平台主要依托长光辰英针对生物样品特点特定研制的单细胞检测级别的共聚焦拉曼光谱仪P300,有效解决了现有材料检测用拉曼光谱设备与分析算法不适于生物拉曼组学研究的问题。
①本文由医疗器械网入驻的作者或注册的会员撰写并发布,观点仅代表作者本人,不代表医疗器械网立场。若内容侵犯到您的合法权益,请及时告诉,我们立即通知作者,并马上删除。
②凡本网注明"来源:医疗器械网"的所有作品,版权均属于医疗器械网,转载时须经本网同意,并请注明医疗器械网(www.120med.com)。
③本网转载并注明来源的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品来源,并自负版权等法律责任。
④若本站内容侵犯到您的合法权益,请及时告诉,我们马上修改或删除。邮箱:hezou_yiqi
最新话题
最新文章
- 应用 | 影响喷墨打印质量的重要参数 - 润湿性
- 基理动态|贺“2024年大型仪器设备开放共享工作创新培训班”及“2024年河北省高等学校实验室安全培训会”成功举办!
- 前沿应用|低场核磁共振技术在油泥含油率检测中的应用
- 拼手速 | “破卷出新”FBIF2024食品创新展,免费赠票!
- 收藏!超全的水凝胶3D细胞培养全流程干货,一看就懂~
- Need | “你的”科研产品需求,我们来满足!(内含福利)
- 探微知著:微塑料多维检测技术的发展与应用
- 《REMOTE SENS ENVIRON》--基于S185高光谱数据消除冠层光谱土壤背景影响实现叶片叶绿素含量监测
- 沃特世推出Xevo MRT质谱仪,为高速、高分辨率的质谱分析树立全新性能标杆
- 如何通过显微镜解决方案保障电池制造安全高效
作者榜
参与评论
登录后参与评论