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浅谈蛋白纯化常用添加剂的选择

来源：Cytiva（思拓凡）分类：科技文献 2024-05-23 09:32:15 21阅读次数

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蛋白纯化过程中保证目标蛋白的稳定性和可溶性是实验成败的关键。一个好的蛋白纯化过程必须在一个有利于目标蛋白保持其良好折叠结构、维持其功能活性的溶液环境中进行，该环境条件包括缓冲液类型、pH值、温度、离子强度以及添加剂的种类等^[1]。

优化蛋白纯化条件以确保

目标蛋白的稳定性和可溶性

缓冲液是一种含有共轭酸/碱对的水溶液，pH值范围根据其pKa值决定，该pKa值定义为50%的分子为酸式结构，50%为碱式结构时的pH值。为了保证良好的缓冲能力，pH值的选择建议不超过体系pKa±0.5，缓冲液浓度一般为20-50 mM，通常选择非挥发性的缓冲液（需要冻干的样品除外）。所用缓冲液的pH值，建议偏离目标蛋白等电点1个pH值以上，自然界中的大多数蛋白质一般在中性pH值的环境中保持较好的活性，不建议选择太酸或太碱的缓冲体系，会影响蛋白质的功能活性。另外，添加盐类物质可以提高缓冲液的离子强度，适量的盐离子有助于增强蛋白质的溶解性、维持其结构稳定性，也可以避免纯化过程中离子型的非特异性吸附。

蛋白质对温度的稳定性一般在4-40 ℃之间，建议每隔10 ℃做温度稳定性测试，至少包括在层析冷柜 (2-8 ℃) 和室温 (22 ℃) 条件下的稳定性检测。在整个纯化过程中，蛋白质最好都保持在2-8 ℃的低温状态下，既能降低酶解速度，又能维持蛋白质的结构完整性。

蛋白纯化过程中常规的溶液组分如表1所示：

表1. 常规的溶液组分^[1]

针对胞内表达的蛋白质，在细菌/细胞裂解阶段还需考虑添加全能核酸酶和蛋白酶抑制剂。全能核酸酶，通过降解所有不同形态的DNA及RNA来降低细胞裂解液的粘度，以改善分离效果，提高蛋白得率，使用浓度一般是1-20 μg/mL（请参考产品说明书）。蛋白酶抑制剂的种类很多，具有各自的作用特点，常用的蛋白酶抑制剂如表2所示^[2]：

表2. 常用的蛋白酶抑制剂

蛋白酶抑制剂可以单独添加，也可以制备成混合物的形式使用，市面上有多种蛋白酶抑制剂混合片剂供选择。

注意：PMSF是一种危险化学品，操作时请做好防护，其在水溶液中的半衰期为35分钟。PMSF通常以10 mM或100 mM储备溶液（1.74或17.4 mg/mL）的形式储存在-20 °C的异丙醇中，AEBSF是PMSF的无毒替代品。另外，在裂解缓冲液中添加25 mM蔗糖或葡萄糖可以稳定溶酶体膜，减少蛋白酶的释放。

为了防止蛋白质发生聚集沉淀或降解，必要时需要加入添加剂来保护蛋白质不被破坏、辅助其正确折叠、维持其稳定性和溶解性。按照添加的优先顺序，归纳总结如下：

第一梯度

温和的添加剂

还原剂 (reducing agent) 可以防止蛋白分子间形成非正常的二硫键，避免蛋白发生聚集沉淀。针对含有半胱氨酸残基的蛋白质，为了维护其正确结构和活性，需要考虑在缓冲液中添加还原剂。还原剂被氧化后会失去作用效果，建议在每次使用前添加，常用的还原剂如表3所示^[3]：

表3. 常用的还原剂

注意：高浓度的还原剂会影响IMAC (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography) 或Chelating填料上金属离子与螯合剂的结合，还会使填料变色。 Ni Sepharose FF/HP/excel填料对还原剂的耐受性请参考对应说明书；TALON Superflow填料请避免使用DTT、DTE和TCEP，最高可以耐受10 mM BME（慎用）。IMAC亲和层析纯化时，注意先走一个空白运行（不加样品，其他步骤一致）去除结合较弱的离子，在填料平衡阶段也可以不加还原剂，上样、洗杂、洗脱过程中再添加。另外，目标蛋白不适合在含有BME的缓冲体系中长期储存，因为氧化形式的BME可以与还原的半胱氨酸反应形成二硫化物，所以BME只建议用于蛋白纯化阶段。蛋白储存液中可以添加DTT、DTE和TCEP等还原剂，它们的氧化形式稳定，不会与游离的半胱氨酸反应。

共溶剂（cosolvent）可以改变溶液的热力学性质，帮助提高蛋白质的溶解度和稳定性，包括糖类、醇类、氨基酸、甘油、多聚物等，最常用的是甘油，如表4所示：

表4. 常用的温和共溶剂

（3）其他温和的添加剂，如表5所示：

表5. 其他温和的添加剂

第二梯度

较温和的添加剂

表面活性剂也称去垢剂 (detergent) ，是一类双亲性分子，它包含亲水的极性部分（头部）和疏水的非极性部分（尾巴），可作为蛋白稳定剂和增溶剂，也能提高洗脱效率，常用浓度为0.01%–1%，根据亲水基团的带电性质可分为离子型（阳离子或阴离子）、非离子型和两性离子型，请见表6：

表6. 去垢剂的分类

在考虑去垢剂应用时，胶束化是一个关键现象。每一种去垢剂都有一个临界胶束浓度CMC (Critical Micelle Concentration) ，其决定了需要使用的去垢剂的量，如表7所示^[3]：

表7. 常见去垢剂的临界胶束浓度 (CMC)

当去垢剂浓度高于CMC时，其单体会自组装成非共价聚集体，也叫胶束。胶束化实际上并不是在一个单一浓度内发生，而是在一个窄的浓度范围内发生，通常被认为是一个动态的结构，胶束内的去垢剂单体与溶液中游离的去垢剂单体快速交换。有研究发现，低浓度下的单体去垢剂基本上不会引起蛋白质主体空间构象的变化，非离子型、两性离子型去垢剂在达到胶束浓度后会影响蛋白质构象，离子型胶束会直接引起蛋白质变性^[4]。

去垢剂的CMC值并不是固定的，它会随着溶液pH值、离子强度和温度的改变发生变化。例如离子型去垢剂的CMC会随着溶液中离子强度的增加而降低。图1展示了去垢剂在盐梯度中达到临界胶束浓度 CMC后，继续提高盐浓度会使去垢剂胶束化导致紫外检测值迅速升高，最终达到一个平台值，这可能会将蛋白峰隐藏，影响峰收集。所以在离子交换层析中使用去垢剂，请先运行空白对照。而且去垢剂也容易起泡，因此尽量避免使用高浓度的去垢剂。需要注意的是，含有芳香环的去垢剂（如Triton X-100、NP-40等）在紫外线区域有吸收，它们可能会干扰分光光度法280 nm处的蛋白质监测。

图1. 去垢剂形成胶束导致紫外检测异常

去垢剂常用于细胞裂解液中，以提高目标蛋白在上清中的可溶性，离心收集的上清上样后，先用大量平衡缓冲液洗去柱上吸附的去垢剂，再进行正常的洗脱步骤。如果整个纯化过程都需要添加去垢剂，那么洗脱阶段需考虑其对紫外检测值的影响，为了不影响下游的应用，在纯化后期需要降低去垢剂的浓度或者直接去除，如果去垢剂与目标蛋白发生结合则很难去除。

聚乙二醇 (PEG) 是一种带有-OH的非离子型水溶性聚合物，是蛋白纯化过程中常用的共溶剂，能够在分子表面形成一种保护膜，使蛋白结构免遭破坏，且具有疏水性及亲水性双重性质。基于空间排阻效应，PEG可以增强样品在亲和层析、离子交换层析等填料上的滞留，增加样品的保留时间，并且该效应对于大分子蛋白或病毒更加显著，因此有利于单体和聚体或颗粒的分离^[5]。PEG主要通过其分子量 (MW) 范围来定义，如PEG 2000代表平均MW为2000 g/mol的PEG分子的混合物。

例如，在Protein A亲和层析中增加PEG 3350/CaCl₂或PEG 3350/NaCl的淋洗和洗脱，可显著提高层析中聚集体与单体的分离，优化后的工艺使聚集体从20%减少到3%-4%^[6]。其中，PEG能延长目标抗体的保留时间，CaCl₂/NaCl能通过改变抗体和Protein A之间的疏水作用来提高填料的选择性，也就是提高分辨率，但CaCl₂/NaCl也可能驱动相反方向的结合，需要根据实际情况进行条件优化。

另外，用PEG修饰蛋白可以解决许多蛋白药物面临的半衰期过短的问题。PEG化改善了蛋白的药理学性质，大多数情况下使得它们在临床上更有效^[^7]。

精氨酸 (Arginine) 是比较常用的添加剂，其作用机理目前尚不明确，主要被认为是通过静电相互作用、疏水相互作用、阳离子-π相互作用等降低蛋白质表面疏水性而使蛋白质稳定，从而减少聚集。在pH 8.0-8.5的体外重折叠溶剂中，精氨酸的用量一般为0.1-2 M。

精氨酸能够有效洗脱单克隆抗体，包括IgG1和IgG4，精氨酸的衍生物，如乙酰精氨酸和胍基丁胺，和精氨酸有类似效果^[8]。在Protein A亲和层析洗脱阶段，相比于单独的柠檬酸，精氨酸可以在更高的pH条件下，促进样品洗脱从而提高回收率，而更温和的洗脱条件也避免了样品因为低pH而产生聚集。在多模式层析中，如果洗脱峰拖尾比较严重，可能是因为疏水作用力的影响，此时可以添加精氨酸，在保障分辨率的前提下缩小洗脱体积。

精氨酸的存在可能会影响某些蛋白质的功能活性及下游的检测，此时需要通过透析或稀释复性等方式温和地去除精氨酸。对于含有二硫键的蛋白质，在复性过程中可以添加氧化还原系统，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、cysteamine/cystamine等来辅助蛋白质的正确折叠。

第三梯度

破坏力强的添加剂

如果蛋白质表达为包涵体或在纯化过程中出现聚集沉淀，则需要添加变性剂溶解。尿素、盐酸胍主要是通过打断包涵体分子间的各种化学键（如氢键、疏水键），使蛋白肽链延伸。盐酸胍的变性能力是尿素的1.5-2.5倍，它能溶解尿素不溶的包涵体。另外，十二烷基硫酸钠 (SDS) 、十二烷基肌氨酸钠 (Sarcosyl) 、十六烷基三甲基氯化铵 (CTAC) 等离子型表面活性剂也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体。如表8所示^[2]：

表8. 常用的变性剂

蛋白质的复性是包涵体纯化中非常关键和复杂的过程，只有选择到了合适的复性方法和复性缓冲液，使蛋白得以正确折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利完成。一般在尿素浓度4 M左右时复性过程开始，到2 M左右时结束；对于盐酸胍而言，可以从4 M开始，到1.5 M时复性过程结束。复性方法主要采用稀释复性、透析复性和柱上复性^[9]，变性剂的起始浓度和去除速度、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的使用等都会影响复性效率。

总结

本文主要介绍了蛋白纯化中常用的添加剂，请尽量选择温和的、容易去除的添加剂，避免蛋白变性或者影响其功能活性，也避免额外的纯化步骤。

参考文献

[1]. Affinity Chromatography Handbook, Vol. 2: Tagged proteins.

[2]. Affinity Chromatography Handbook, Vol.1: Antibodies.

[3]. Strategies for Protein Purification Handbook CY13986.

[4]. Daniel E. Otzen, et al. α-Lactalbumin is unfolded by all classes of surfactants but by different mechanisms [J]. Journal of Colloid and Interface Science, 329: 273-283, 2009.

[5]. Tsutomu Arakawa et al. Excluded Cosolvent in Chromatography [J]. Journal of Pharmaceutical Sciences,107: 2297-2305, 2018.

[6]. Yuan Zhang, et al. A method for improving protein A chromatography's aggregate removal capability [J]. Protein Expression and Purification, 158: 65-73, 2019.

[7]. Veronese FM, et al. PEGylation, successful approach to drug delivery [J]. Drug Discovery Today, 10(21): 1451-1458, 2005.

[8]. Daisuke Ejima, et al. Effective elution of antibodies by arginine and arginine derivatives in affinity column chromatography [J]. Analytical Biochemistry, 345: 250-257, 2005.

[9]. Purifying challenging proteins Handbook, Principles and methods.

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